Упрощенный обратный метод генетики для восстановления рекомбинантных ротавирусов Экспрессинг Репортер белки

Ротавирусы являются основными причинами тяжелого гастроэнтерита у младенцев и маленьких детей, а также молодых многих других млекопитающих и птиц видов¹. Как члены семейства Reoviridae, ротавирусы имеют сегментированный двухцепочечный геном РНК (dsRNA). Сегменты генома содержатся в неописуемом икосахедря, образованном из трех концентрических слоев белка^2. На основе секвенирования и филогенетического анализа сегментов генома было определено девять видов ротавируса (A’D, F-J)³. Эти штаммы, включающие ротавирусного вида А, ответственны за подавляющее большинство болезней человека^4. Внедрение ротавирусных вакцин в программы иммунизации детей, начиная с последнего десятилетия, коррелирует со значительным снижением смертности и заболеваемости ротавирусом. Примечательно, что число случаев смерти детей, связанных с ротавирусом, сократилось с примерно 528 000 в 2000 году до 128 500 в 2016 году^4,,5. Ротавирусные вакцины формулируются из живых ослабленных штаммов вируса, при этом детям к 6 месяцам вводят от 2 до 3 доз. Большое количество генетически разнообразных штаммов ротавируса, циркулирующих в людях и других видах млекопитающих, в сочетании с их способностью быстро развиваться через мутагенез и реассортизу, может привести к антигенным изменениям в типах ротавирусов, заражающих детей^6,,7,8. Такие изменения могут подорвать эффективность существующих вакцин, что требует их замены или модификации.

Разработка полностью плазмедных систем обратной генетики, позволяющих манипулировать любым из 11 сегментов ротавирусного генома, только недавно была достигнута^9. С наличием этих систем стало возможным разгадать молекулярные детали репликации ротавируса и патогенеза, разработать усовершенствованные методы скрининга высокой пропускной записи на антиротавирусные соединения и создать новые потенциально более эффективные классы ротавирусных вакцин. Во время репликации ротавируса, ограниченные вирусные (К) РНК не только направляют синтез вирусных белков, но и служат шаблонами для синтеза потомства сегментов генома dsRNA^10,11. Все ротавирусные системы обратной генетики, описанные на сегодняшний день, полагаются на трансфекцию переносчиков транскрипции T7 в клеточные линии млекопитающих в качестве источника кДНК-производных (Я)РНК, используемых в восстановлении рекомбинантных вирусов^9,12,13. В транскрипции векторов, полнометражные вирусные cDNAs расположены между вверх по течению T7 промоутер и вниз по течению вируса дельты гепатита (HDV) ribozyme таким образом, что вирусные (К) РНК синтезируются T7 РНК полимеразы, которые содержат подлинные 5′ и 3′-терминини (Рисунок 1A). В системе обратной генетики первого поколения рекомбинантные вирусы были сделаны путем трансфектирования клеток почек хомяка, выражающего полимеразу T7 РНК (BHK-T7) с 11 векторами транскрипции T7 (pT7), каждый направляющий синтез уникального (к) РНК штамма вируса SA11, и три CMV промоутер-драйв выражение плазмиды, один кодирования птичьего реовируса p10FAST синтеза белка и два encoding подразделения вируса вакцины D1R-D12L capping комплекс⁹. Рекомбинантные вирусы SA11, генерируемые в трансинфицированных клетках BHK-T7, были усилены путем наблюдения с помощью MA104 клеток, клеточной линии, разрешительной для роста ротавируса. Измененная версия системы обратной генетики первого поколения была описана, что больше не использует поддержку плазмиды¹². Вместо этого, модифицированная система успешно генерирует рекомбинантные ротавирусы просто путем трансфектации BHK-T7 клеток с 11 SA11 T7 транскрипции векторов, с оговоркой, что векторы для вирусной фабрики (viroplasm) строительные блоки (неструктурные белки NSP2 и NSP5) добавляются на уровнях 3 раза выше, чем другие векторы^14.15 Также разработаны модифицированные версии системы обратной генетики, которые поддерживают восстановление штаммов ротавируса^16,,17. Геном ротавируса удивительно поддается манипуляции обратной генетики, с рекомбинантными вирусами, генерируемыми на сегодняшний день с мутациями, введенными в VP4¹⁸, NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21, и NSP5^22,23. Среди наиболее полезных вирусов, генерируемых до сих пор являются те, которые были разработаны, чтобы выразить флуоресцентные белки репортера (FPs)^{9,12,21,24,25}.

В этой публикации мы предоставляем протокол для обратной генетической системы, которую мы используем в нашей лаборатории для генерации рекомбинантных штаммов ротавируса SA11. Ключевой особенностью нашего протокола является совместное перевод конторы клеток BHK-T7 с 11 переносчиками транскрипции pT7 (модифицированные, чтобы включить 3x уровни pT7/NSP2SA11 и pT7/NSP5SA11 векторов) иFigure 2вектор экспрессии CMV, кодирующий африканский свиной вирус (ASFV) NP868R.²¹ В наших руках наличие плазмиды NP868R приводит к выработке более высоких титрах рекомбинантных вирусов трансфицировоками БХК-Т7. В этой публикации мы также предоставляем протокол для изменения плазмида pT7/NSP3SA11 таким образом, что могут быть созданы рекомбинантные вирусы, которые выражают не только белок сегмента 7 NSP3, но и отдельный FP. Это достигается путем реинжиниринга NSP3 открытого чтения кадра (ORF) в pT7/NSP3SA11 плазмид содержать вниз по течению 2A переводный стоп-перезагрузки элемент следуют FP ORF (Рисунок 1B)^24,26. Благодаря этому подходу, мы создали рекомбинантные ротавирусы, выражающие различные FPs: UnaG (зеленый), mKate (далеко-красный), mRuby (красный), TagBFP (синий), CFP (циан), и YFP (желтый)^24,27,28. Эти FP-выражения ротавирусов производятся без удаляя NSP3 ORF, таким образом, что дает вирусы, которые, как ожидается, кодируют полный комплект функционирующих вирусных белков.