Método de genética reversa simplificado para recuperar rotavírus recombinantes expressando proteínas de repórter

Os rotavírus são as principais causas de gastroenterite grave em bebês e crianças pequenas, bem como os filhotes de muitas outras espécies de mamíferos e aviários¹. Como membros da família Reoviridae, os rotavírus têm um genoma de RNA de dupla cadeia segmentada (dsRNA). Os segmentos do genoma estão contidos dentro de uma virion icosaedro não envolta formada a partir de três camadas concêntricas de proteína². Com base no sequenciamento e análise filogenética dos segmentos do genoma, foram definidas nove espécies de rotavírus (A−D, F−J)³. Essas cepas que compreendem a espécie rotavírus A são responsáveis pela grande maioria da doença humana⁴. A introdução de vacinas rotavírus em programas de imunização infantil a partir da última década está correlacionada com reduções significativas na mortalidade e morbidade de rotavírus. Mais notavelmente, o número de mortes infantis associadas ao rotavírus diminuiu de aproximadamente 528.000 em 2000 para 128.500 em 2016^4,5. As vacinas rotavírus são formuladas a partir de cepas atenuantes vivas do vírus, com 2 a 3 doses administradas em crianças até 6 meses de idade. O grande número de cepas de rotavírus geneticamente diversas que circulam em humanos e outras espécies de mamíferos, combinadas com sua capacidade de evoluir rapidamente através de mutagênese e reclassificação, pode levar a alterações antigênicas nos tipos de rotavírus que infectam crianças^6,7,8. Tais alterações podem minar a eficácia das vacinas existentes, exigindo sua substituição ou modificação.

O desenvolvimento de sistemas de genética reversa totalmente baseados em plasmídeos que permitem a manipulação de qualquer um dos 11 segmentos do genoma rotavírus foi alcançado recentemente⁹. Com a disponibilidade desses sistemas, tornou-se possível desvendar detalhes moleculares de replicação de rotavírus e patogênese, desenvolver métodos aprimorados de triagem de alto desempenho para compostos anti-rotavírus e criar novas classes potencialmente mais eficazes de vacinas rotavírus. Durante a replicação do rotavírus, as RNAs virais (+)não só orientam a síntese de proteínas virais, mas também servem como modelos para a síntese dos segmentos do genoma dsRNA da progêia^10,11. Todos os sistemas genéticos reversos de rotavírus descritos até hoje dependem da transfecção de vetores de transcrição T7 em linhas celulares de mamíferos como fonte de cDNA derivado (+)RNAs usados na recuperação de vírus recombinantes^9,,12,13. Dentro dos vetores de transcrição, os cDNAs virais de comprimento completo são posicionados entre um promotor T7 a montante e o ribozyme de hepatite delta (HDV) de tal forma que as rnas virais (+)RNAs são sintetizadas por polimerase T7 RNA que contêm autênticos 5′ e 3′-termini(Figura 1A). No sistema de genética reversa de primeira geração, os vírus recombinantes foram feitos por células renais de hamster de bebê transfeccionaexpressas T7 RNA polimerase (BHK-T7) com 11 vetores de transcrição T7 (pT7), cada uma síntese direcional de um Único (+)RNA da cepa do vírus SA11 símio, e três plasmídeos de expressão de unidade de promotor cmv, um codificando a proteína de fusão aviária reovirus p10FAST e duas subunidades codificadoras do vírus da vaccinia D1R-D12L capping enzima complexo⁹. Os vírus SA11 recombinantes gerados em células BHK-T7 transfeccionadas foram amplificados pela supervisão com células MA104, uma linha celular permissiva para o crescimento de rotavírus. Uma versão modificada do sistema de genética reversa de primeira geração foi descrita que não usa mais plasmídeos de suporte¹². Em vez disso, o sistema modificado gera com sucesso rotavírus recombinantes simplesmente transfecting células BHK-T7 com os vetores de transcrição 11 SA11 T7, com a ressalva de que os vetores para os blocos de construção da fábrica viral (viroplasma) (proteínas não estruturais NSP2 e NSP5) são adicionados a níveis 3 vezes maiores que os outros vetores^14,15. Também foram desenvolvidas versões modificadas do sistema genético reverso que suportam a recuperação das cepas humanas de KU e Odelia do rotavírus^16,17. O genoma rotavírus é notavelmente passível de manipulação por genética reversa, com vírus recombinantes gerados até hoje com mutações introduzidas em VP4¹⁸, NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21, e NSP5^22,23. Entre os vírus mais úteis gerados até agora estão aqueles que foram projetados para expressar proteínas fluorescentes de repórteres (FPs)^{9,12,21,24,25}.

Nesta publicação, fornecemos o protocolo para o sistema de genética reversa que usamos em nosso laboratório para gerar cepas recombinantes de rotavírus SA11. A principal característica do nosso protocolo é a cofecção de células BHK-T7 com os vetores de transcrição 11 pT7 (modificados para incluir níveis de 3x da enzima de capping pT7/NSP2SA11 e pT7/NSP5SA11) e um vetor de expressão CMV codificando o vírus da peste suína africana (ASFV) NP868R enzique²¹ (Figura 2). Em nossas mãos, a presença do plasmídeo NP868R leva à produção de títulos mais altos de vírus recombinantes por células BHK-T7 transfeccionadas. Nesta publicação, também fornecemos um protocolo para modificar o plasmídeo pT7/NSP3SA11 para que vírus recombinantes possam ser gerados que expressem não apenas o produto de proteína nSP3 do segmento 7, mas também um FP separado. Isso é feito pela reengenharia do quadro de leitura aberta NSP3 (ORF) no plasmídeo pT7/NSP3SA11 para conter um elemento de reinicialização translacional 2A a jusante seguido de um FP ORF(Figura 1B)^24,26. Através desta abordagem, geramos rotavírus recombinantes expressando vários FPs: UnaG (verde), mKate (vermelho distante), mRuby (vermelho), TagBFP (azul), CFP (ciano) e YFP (amarelo)^24,27,28. Esses rotavírus que expressam FP são feitos sem excluir o NSP3 ORF, produzindo assim vírus que devem codificar um complemento completo de proteínas virais em funcionamento.