Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Rotavirussen zijn belangrijke oorzaken van ernstige gastro-enteritis bij zuigelingen en jonge kinderen, evenals de jongen van vele andere zoogdier- en vogelsoorten¹. Als leden van de Reoviridae familie hebben rotavirussen een gesegmenteerd dubbelstrengs RNA (dsRNA) genoom. De genoomsegmenten bevinden zich in een niet-gehulde icosahedralvirion gevormd uit drie concentrische lagen eiwit^2. Op basis van sequencing en fylogenetische analyse van de genoomsegmenten zijn negen soorten rotavirus (A−D, F−J) gedefinieerd³. Deze stammen die rotavirussoort A omvatten, zijn verantwoordelijk voor de overgrote meerderheid van de menselijke ziekte⁴. De introductie van rotavirusvaccins in kindervaccinatieprogramma’s die in het laatste decennium beginnen, is gecorreleerd met een aanzienlijke vermindering van de mortaliteit en morbiditeit van het rotavirus. Het meest in het bijzonder is het aantal sterfgevallen door rotavirus gerelateerde sterfgevallen bij kinderen gedaald van ongeveer 528.000 in 2000 tot 128.500 in 2016^4,5. Rotavirus vaccins zijn geformuleerd uit levende verzwakte stammen van het virus, met 2 tot 3 doses toegediend aan kinderen door 6 maanden oud. Het grote aantal genetisch diverse rotavirusstammen die circuleren bij mensen en andere zoogdiersoorten, in combinatie met hun vermogen om snel te evolueren door middel van mutagenese en herassortiment, kan leiden tot antigene veranderingen in de soorten rotavirussen infecteren kinderen^6,7,8. Dergelijke veranderingen kunnen de werkzaamheid van bestaande vaccins ondermijnen, waardoor ze moeten worden vervangen of gewijzigd.

De ontwikkeling van volledig plasmid-gebaseerde omgekeerde geneticasystemen die manipulatie van om het even welk van de 11 rotavirusgenoomsegmenten toelaten werd slechts onlangs bereikt⁹. Met de beschikbaarheid van deze systemen is het mogelijk geworden om moleculaire details van rotavirusreplicatie en pathogenese te ontrafelen, verbeterde screeningsmethoden met hoge doorvoer voor anti-rotavirusverbindingen te ontwikkelen en nieuwe potentieel effectievere klassen van rotavirusvaccins te creëren. Tijdens de replicatie van het rotavirus leiden afgetopte virale (+)RNA’s niet alleen de synthese van virale eiwitten, maar dienen ze ook als sjablonen voor de synthese van progeny dsRNA genoomsegmenten^10,11. Alle rotavirus reverse genetica systemen beschreven tot op heden vertrouwen op de transfection van T7 transcriptie vectoren in zoogdier cellijnen als een bron van cDNA-afgeleide (+)RNAs gebruikt bij het herstellen van recombinant virussen^9,12,13. Binnen de transcriptievectoren worden virale cDNO’s over de hele lengte geplaatst tussen een upstream T7-promotor en een downstream hepatitis deltavirus (HDV) ribozyme, zodat virale (+)RNA’s worden gesynthetiseerd door T7 RNA polymerase die authentieke 5′ en 3’termini (figuur 1A) bevatten. In de eerste generatie reverse genetica systeem, recombinante virussen werden gemaakt door transfecting baby hamster niercellen uitdrukken T7 RNA polymerase (BHK-T7) met 11 T7 (pT7) transcriptie vectoren, elke regiesynthese van een uniek (+)RNA van de simian SA11 virusstam, en drie CMV promoter-drive expression plasmiden, één die het aviaire reovirus p10FAST-fusie-eiwit codeert en twee coderingssubeenheden van het vacciniavirus D1R-D12L capping enzymcomplex⁹. Recombinant SA11 virussen gegenereerd in transfected BHK-T7 cellen werden versterkt door toezicht met MA104 cellen, een cellijn tolerant voor rotavirus groei. Een aangepaste versie van de eerste generatie reverse genetica systeem is beschreven dat niet langer gebruik maakt van steun plasmiden¹². In plaats daarvan genereert het gewijzigde systeem met succes recombinante rotavirussen door bhk-T7-cellen te transfecteren met de 11 SA11 T7 transcriptievectoren, waarbij het voorbehoud is dat vectoren voor de virale fabriek (viroplasma) bouwstenen (niet-structurele eiwitten NSP2 en NSP5) worden toegevoegd op niveaus die 3 keer hoger liggen dan de andere vectoren^14,15. Gewijzigde versies van het omgekeerde genetica systeem zijn ook ontwikkeld die het herstel van de menselijke KU en Odelia stammen van rotavirus^16,17ondersteunen . Het rotavirus genoom is opmerkelijk vatbaar voor manipulatie door omgekeerde genetica, met recombinant virussen gegenereerd tot op heden met mutaties geïntroduceerd in VP4¹⁸, NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21, en NSP5^22,23. Onder de meest nuttige virussen die tot nu toe zijn gegenereerd, zijn die welke zijn ontworpen om fluorescerende reporter eiwitten (FPs)^{9,12,,21,24,25}uit te drukken .

In deze publicatie bieden we het protocol voor het omgekeerde geneticasysteem dat we in ons laboratorium gebruiken om recombinante stammen van SA11 rotavirus te genereren. Het belangrijkste kenmerk van ons protocol is co-transfection van BHK-T7 cellen met de 11 pT7 transcriptie vectoren (gewijzigd om 3x niveaus van de pT7/NSP2SA11 en pT7/NSP5SA11 vectoren) en een CMV expressie vector codering van de Afrikaanse varkenspest virus (ASFV) NP868R capping enzym²¹ (Figuur 2). In onze handen leidt de aanwezigheid van de NP868R plasmid tot de productie van hogere titers van recombinante virussen door getransfecteerde BHK-T7 cellen. In deze publicatie bieden we ook een protocol voor het wijzigen van de pT7/NSP3SA11 plasmide zodanig dat recombinante virussen kunnen worden gegenereerd die niet alleen het segment 7 eiwitproduct NSP3 uitdrukken, maar ook een aparte FP. Dit wordt bereikt door het Open Leeskader (ORF) van NSP3 in het pT7/NSP3SA11 plasmide opnieuw te ontwerpen en een downstream 2A translationeel stop-restart-element te bevatten, gevolgd door een FP ORF (Figuur 1B)^24,26. Door deze aanpak hebben we recombinante rotavirussen gegenereerd die verschillende FP’s uitdrukken: UnaG (groen), mKate (verrood), mRuby (rood), TagBFP (blauw), GVB (cyaan) en YFP (geel)^24,27,28. Deze FP-expressing rotavirussen worden gemaakt zonder de NSP3 ORF te verwijderen, waardoor virussen worden opgedaan die naar verwachting een volledige aanvulling van functionerende virale eiwitten zullen coderen.