طريقة مبسطة علم الوراثة العكسي لاسترداد الفيروسات الروتا المؤتلفة التعبير عن البروتينات مراسل
Summary
يوفر توليد فيروسات الروتا المؤتلفة من الحمض النووي البلازمي أداة أساسية لدراسة تكرار فيروس الروتا ومسببات الأمراض ، وتطوير ناقلات التعبير عن فيروس الروتا واللقاحات. هنا، نحن نصف نهج علم الوراثة العكسي المبسط لتوليد فيروسات الروتا المؤتلفة، بما في ذلك سلالات تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت.
Abstract
فيروسات الروتا هي مجموعة كبيرة ومتطورة من فيروسات الحمض النووي الريبي المجزأة المزدوجة التي تسبب التهاب المعدة والأمعاء الحاد في صغار العديد من الأنواع المضيفة للثدييات والطيور، بما في ذلك البشر. ومع ظهور أنظمة الوراثة العكسية لفيروس الروتا مؤخراً، أصبح من الممكن استخدام الطفرات الموجهة لاستكشاف بيولوجيا فيروس الروتا، وتعديل لقاحات فيروس الروتا الموجودة وتحسينها، وتطوير ناقلات اللقاحات متعددة الأهداف لفيروس الروتا. في هذا التقرير، نحن نصف نظام علم الوراثة العكسي المبسط الذي يسمح بالتعافي الفعال والموثوق به من فيروسات الروتا المؤتلفة. ويستند النظام على التطفل المشترك من ناقلات النسخ T7 التعبير عن كامل طول rotavirus (+) RNAs وناقل CMV ترميز إنزيم غطاء الحمض النووي الريبي في خلايا BHK إنتاج اسيشن ايمرياز T7 الحمض النووي الريبي (BHK-T7). يتم تضخيم فيروسات الروتا المؤتلفة من خلال الإشراف على خلايا BHK-T7 المصابة عبرها مع خلايا MA104 ، وهو خط خلية الكلى القرد الذي هو متساهل للغاية لنمو الفيروس. في هذا التقرير، نحن أيضا ً نصف نهج لتوليد فيروسات الروتا المؤتلفة التي تعبر عن بروتين مراسل فلوري منفصل من خلال إدخال عنصر إيقاف إعادة التشغيل الترجمي 2A في الجزء 7 من الجينوم (NSP3). هذا النهج يتجنب حذف أو تعديل أي من إطارات القراءة المفتوحة الفيروسية، مما يسمح لإنتاج فيروسات الروتا المؤتلفة التي تحتفظ بالبروتينات الفيروسية تعمل بكامل طاقتها مع التعبير عن بروتين الفلورسنت.
Introduction
فيروسات الروتا هي الأسباب الرئيسية لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد في الرضع والأطفال الصغار ، وكذلك الشباب من العديد من الثدييات الأخرى والطيورالأنواع 1. كأعضاء في عائلة Reoviridae، الفيروسات الدوارة لديها تجزئة الحمض النووي الريبي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsRNA) الجينوم. وترد شرائح الجينوم داخل فيرجيون icosahedral غير مغلفة تشكلت من ثلاث طبقات متحدة المركز من البروتين2. واستناداً إلى التسلسل والتحليل الجيني لأجزاء الجينوم، تم تحديد تسعة أنواع من فيروس الروتا (A-D, F−J)3. تلك السلالات التي تتألف من أنواع فيروس الروتا A هي المسؤولة عن الغالبية العظمى من الأمراض البشرية4. ويرتبط إدخال لقاحات فيروس الروتا في برامج تحصين الأطفال ابتداء من العقد الماضي بتخفيضات كبيرة في وفيات واعتلال فيروس الروتا. وعلى وجه الخصوص، انخفض عدد وفيات الأطفال المرتبطة بفيروس الروتا من حوالي 528,000 في عام 2000 إلى 128,500 في عام 20164,5. يتم صياغة لقاحات فيروس الروتا من سلالات حية مخففة من الفيروس، مع إعطاء 2 إلى 3 جرعات للأطفال بحلول 6 أشهر من العمر. قد يؤدي العدد الكبير من سلالات فيروس الروتا المتنوعة وراثيًا المتداولة في البشر وأنواع الثدييات الأخرى ، إلى جانب قدرتها على التطور السريع من خلال الطفرات وإعادة الفرز ، إلى تغييرات مضادة للجينات في أنواع فيروسات الروتا التي تصيب الأطفال6و7و8. وقد تقوض هذه التغييرات فعالية اللقاحات الموجودة، مما يتطلب استبدالها أو تعديلها.
ولم يتحقق سوى مؤخرا ً 9 تطوير نظم علم الوراثة العكسية القائمة على البلازميد9بالكامل التي تمكن من التلاعب بأي من شرائح جينوم فيروس الروتا 11. ومع توافر هذه النظم، أصبح من الممكن كشف التفاصيل الجزيئية لتكرار فيروس الروتا ومسبباته، وتطوير أساليب فحص عالية الإنتاجية محسنة لمركبات مكافحة فيروس الروتا، وإنشاء فئات جديدة يمكن أن تكون أكثر فعالية من لقاحات فيروس الروتا. أثناء تكرار فيروس الروتا، توج الفيروسية (+) RNAs ليس فقط دليل توليف البروتينات الفيروسية، ولكن أيضا بمثابة قوالب لتركيب شرائح الجينوم dsRNA ذرية10،11. تعتمد جميع أنظمة الوراثة العكسية للفيروس الروتا الموصوفة حتى الآن على نقل ناقلات النسخ T7 إلى خطوط خلايا الثدييات كمصدر لـ cDNA المشتقة (+) RNAs المستخدمة في استعادة الفيروسات المؤتلفة9،12،13. داخل ناقلات النسخ ، يتم وضع الأقراص الفيروسية الكاملة الطول بين مروج T7 المنبع وفيروس دلتا التهاب الكبد المصب (HDV) ribozyme بحيث يتم تصنيعها من قبل البوليميراز T7 RNA التي تحتوي على أصلية 5 ‘ و 3’-termini(الشكل 1A). في الجيل الأول من نظام علم الوراثة العكسي ، تم إجراء الفيروسات المؤتلفة عن طريق نقل خلايا الكلى الطفل الهامستر التعبير عن T7 RNA polymerase (BHK-T7) مع 11 T7 (pT7) ناقلات النسخ ، كل توليف توجيه فريدة من نوعها (+) الجيش الملكي النيبالي من سلالة الفيروس SA11 simian، وثلاثة CMV المروج محرك التعبير plasmids، واحد ترميز بروتين انصهار reovirus الطيور p10FAST ووحدتين فرعيتين ترميز من فيروس vaccinia D1R-D12L توج إنزيم معقدة9. تم تضخيم الفيروسات SA11 المؤتلفة المتولدة في خلايا BHK-T7 المصابة المنقولة من خلال الإشراف على خلايا MA104 ، وهو خط خلية متساهل لنمو فيروس الروتا. وقد وصفت نسخة معدلة من الجيل الأول من نظام علم الوراثة العكسية التي لم تعد تستخدم دعم plasmids12. بدلا من ذلك، يولد النظام المعدل بنجاح فيروسات روتا المؤتلفة ببساطة عن طريق نقل خلايا BHK-T7 مع ناقلات النسخ SA11 T7 11، مع التحذير من أن ناقلات للمصنع الفيروسي (viroplasm) كتل البناء (البروتينات غير الهيكلية NSP2 و NSP5) تضاف عند مستويات 3 أضعاف أعلى من ناقلات أخرى14،15. كما تم تطوير نسخ معدلة من نظام علم الوراثة العكسي التي تدعم الانتعاش من سلالات KU وOdelia البشرية من فيروس الروتا16,17. الجينوم الفيروس الروتا قابلة بشكل ملحوظ للتلاعب عن طريق علم الوراثة العكسي، مع الفيروسات المؤتلفة ولدت حتى الآن مع الطفرات التي أدخلت في VP418،NSP19،NSP219،NSP320،,21،وNSP522،,23. من بين الفيروسات الأكثر فائدة التي تم إنشاؤها حتى الآن هي تلك التي تم هندستها للتعبير عن البروتينات مراسل الفلورسنت (FPs)9،12،21،24،25.
في هذا المنشور، ونحن نقدم بروتوكول لنظام علم الوراثة العكسي التي نستخدمها في مختبرنا لتوليد سلالات المؤتلفة من فيروس الروتا SA11. السمة الرئيسية لبروتوكولنا هي التطفل المشترك لخلايا BHK-T7 مع ناقلات النسخ pT7 11 (المعدلة لتشمل مستويات 3x من pT7/NSP2SA11 و pT7/NSP5SA11 vectors) وناقل تعبير CMV ترميز فيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV) NP868R توج الإنزيم21 (الشكل 2). في أيدينا، وجود البلازميد NP868R يؤدي إلى إنتاج أعلى titers من الفيروسات المؤتلفة من قبل خلايا BHK-T7 المصابة. في هذا المنشور، ونحن نقدم أيضا بروتوكول لتعديل pT7/NSP3SA11 plasmid بحيث يمكن إنشاء الفيروسات المؤتلفة التي تعبر ليس فقط عن الجزء 7 البروتين المنتج NSP3 ولكن أيضا FP منفصلة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إعادة هندسة إطار القراءة المفتوحة NSP3 (ORF) في pT7/NSP3SA11 plasmid لاحتواء عنصر إيقاف إعادة التشغيل التحويلي 2A المصب متبوعاً بـ FP ORF(الشكل 1B)24،26. من خلال هذا النهج، قمنا بتوليد فيروسات روتا المؤتلفة التي تعبر عن مختلف FPs: UnaG (الأخضر)، mKate (أحمر بعيد)، mRuby (الأحمر)، TagBFP (الأزرق)، CFP (سماوي)، وYFP (أصفر)24،27،28. يتم إجراء هذه الفيروسات الروتا التعبير ية FP دون حذف ORF NSP3 ، وبالتالي تسفر عن الفيروسات التي من المتوقع أن ترميز مجموعة كاملة من البروتينات الفيروسية العاملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في مختبرنا، ونحن نعتمد بشكل روتيني على بروتوكول علم الوراثة العكسي الموصوف هنا لإنتاج فيروسات روتا SA11 المؤتلفة. مع هذا النهج ، والأفراد مع خبرة ضئيلة في تقنيات البيولوجيا الجزيئية أو العمل مع الفيروسات الروتا استرداد الفيروسات المؤتلفة حتى في محاولتهم الأولى. لقد قمنا بتوليد ما يقرب من 10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R03 AI131072 وR21 AI144881، جامعة انديانا تمويل بدء التشغيل، ولورانس M. بلات الوقف. نشكر أعضاء مختبر روتاهوسير، أولريش ديسيلبرغر، وغيدو بابا على مساهماتهم واقتراحاتهم العديدة في تطوير بروتوكول علم الوراثة العكسي.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
