Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

I rotavirus sono le principali cause di gastroenterite grave nei neonati e nei bambini piccoli, così come i giovani di molti altri mammiferi e specie aviarie¹. Come membri della famiglia Reoviridae, i rotavirus hanno un genoma di RNA a doppio filamento (dsRNA) segmentato. I segmenti del genoma sono contenuti all’interno di un virione icosaedro non avvolto formato da tre strati concentrici di proteine². Sulla base del sequenziamento e dell’analisi filogenetica dei segmenti del genoma, sono state definite nove specie di rotavirus (A, D, F,J)³. I ceppi che comprendono la specie a rotavirus A sono responsabili della stragrande maggioranza delle malattie umane⁴. L’introduzione di vaccini rotavirus nei programmi di immunizzazione infantile a partire dall’ultimo decennio è correlata a riduzioni significative della mortalità e morbilità del rotavirus. In particolare, il numero di decessi infantili associati al rotavirus è diminuito da circa 528.000 nel 2000 a 128.500 nel 2016^4,5. I vaccini Rotavirus sono formulati da ceppi vivi attenuati del virus, con 2 a 3 dosi somministrate ai bambini entro i 6 mesi di età. Il gran numero di ceppi di rotavirus geneticamente diversi che circolano negli esseri umani e in altre specie di mammiferi, combinato con la loro capacità di evolversi rapidamente attraverso la mutagenesi e il riassortimento, può portare a cambiamenti antigenici nei tipi di rotavirus che infettano i bambini^6,7,8. Tali cambiamenti possono compromettere l’efficacia dei vaccini esistenti, richiedendone la sostituzione o la modifica.

Lo sviluppo di sistemi di genetica inversa completamente basati su plasmide che consentono la manipolazione di uno qualsiasi degli 11 segmenti del genoma del rotavirus è stato raggiunto solo di recente⁹. Con la disponibilità di questi sistemi, è diventato possibile svelare i dettagli molecolari della replicazione del rotavirus e della patogenesi, sviluppare migliori metodi di screening ad alto throughput per i composti anti-rotavirus e creare nuove classi potenzialmente più efficaci di vaccini rotavirus. Durante la replicazione del rotavirus, gli RNA con tappo non solo guidano la sintesi delle proteine virali, ma fungono anche da modelli per la sintesi dei segmenti del genoma della progenie dsRNA^10,11. Tutti i sistemi di genetica inversa del rotavirus descritti fino ad oggi si basano sulla trasfezione dei vettori di trascrizione T7 nelle linee cellulari dei mammiferi come fonte di RNA derivati da cDNA , utilizzati per recuperare virus ricombinanti^9,12,13. All’interno dei vettori di trascrizione, i cDNA virali a tutta lunghezza sono posizionati tra un promotore T7 a monte e il virus dell’epatite delta a valle (HDV) ribozyme in modo tale che gli RNA virali sono sintetizzati da polimerasi T7 RNA che contengono autentici 5′ e 3 termini(Figura 1A). Nel sistema di genetica inversa di prima generazione, i virus ricombinanti sono stati fatti traducendo cellule renali del criceto per bambini che esprimono la polimerasi t7 RNA (BHK-T7) con 11 vettori di trascrizione T7 (pT7), ogni sintesi diretta di un unico (-)RNA del ceppo virus simian SA11, e tre plasmidi di espressione promotore-drive CMV, uno che codifica la proteina di fusione aviaria reovirus p10FAST e due sottounità di codifica del virus vaccini D1R-D12L filare enzima complesso⁹. I virus SA11 ricombinanti generati nelle cellule BHK-T7 trasfette sono stati amplificati dal semina con cellule MA104, una linea cellulare permissiva per la crescita del rotavirus. È stata descritta una versione modificata del sistema di genetica inversa di prima generazione che non utilizza più plasmidi di supporto¹². Invece, il sistema modificato genera con successo rotavirus ricombinanti semplicemente traducendo le cellule BHK-T7 con i 11 vettori di trascrizione SA11 T7, con l’avvertenza che i vettori per la fabbrica virale (viroplasmo) blocchi costitutivi (proteine non strutturali NSP2 e NSP5) vengono aggiunti a livelli 3 volte superiori rispetto agli altri vettori^14,15. Sono state sviluppate anche versioni modificate del sistema di genetica inversa che supportano il recupero dei ceppi umani KU e Odelia del rotavirus^16,17. Il genoma del rotavirus è notevolmente suscettibile alla manipolazione da parte della genetica inversa, con virus ricombinanti generati fino ad oggi con mutazioni introdotte in VP4¹⁸, NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21e NSP5^22,23. Tra i virus più utili generati finora ci sono quelli che sono stati progettati per esprimere proteine reporter fluorescenti (FP)^{9,12,21,24,25}.

In questa pubblicazione, forniamo il protocollo per il sistema di genetica inversa che usiamo nel nostro laboratorio per generare ceppi ricombinanti del rotavirus SA11. La caratteristica chiave del nostro protocollo è la co-transfezione delle cellule BHK-T7 con i vettori di trascrizione 11 pT7 (modificati per includere livelli 3x dei vettori pT7/NSP2SA11 e pT7/NSP5SA11) e unFigure 2vettore di espressione CMV che codifica il virus della peste suina africana (ASFV) NP868R).²¹ Nelle nostre mani, la presenza del plasmide NP868R porta alla produzione di più alti titer di virus ricombinanti da parte di cellule BHK-T7 trafette. In questa pubblicazione, forniamo anche un protocollo per modificare il pLasmide pT7/NSP3SA11 in modo che possano essere generati virus ricombinanti che esprimono non solo il prodotto proteico segmento 7 NSP3 ma anche un FP separato. Questa operazione viene eseguita ri-ingegnerizzando il frame di lettura aperto NSP3 (ORF) nel plasmid pT7/NSP3SA11 per contenere un elemento downstream 2A di arresto traslazionale 2A seguito da un FP ORF (Figura 1B)^24,26. Attraverso questo approccio, abbiamo generato rotavirus ricombinanti che esprimono vari FP: UnaG (verde), mKate (molto rosso), mRuby (rosso), TagBFP (blu), CFP (ciano) e YFP (giallo)^24,27,28. Questi rotavirus che esprimono FP sono fatti senza eliminare l’OrF NSP3, producendo così virus che dovrebbero codificare un completo complemento di proteine virali funzionanti.