리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화

로타 바이러스는 유아와 어린 아이들에 있는 가혹한 위장염의 중요한 원인, 뿐만 아니라 많은 그밖 포유류 및 조류 종의 젊은^1. Reoviridae 가족의 일원으로서, 로타바이러스는 분할된 이중 가닥 RNA (dsRNA) 게놈이 있습니다. 게놈 세그먼트는 단백질^2의3개의 동심 층에서 형성된 비 봉투에 싸인 icosahedral virion 안에 포함됩니다. 게놈 세그먼트의 시퀀싱 및 계통유전학 적 분석에 기초하여, 9종의 로타바이러스(A−D, F−J)가^3가지로정의되었다. 로타바이러스 종 A를 포함하는 이들 균주는 대부분의 인간 질환에 대한 책임이 있다^4. 지난 10 년 에서 시작 된 어린 시절 예방 접종 프로그램에 로타 바이러스 백신의 도입은 로타 바이러스 사망률과 이환율의 상당한 감소와 상관 관계가 있습니다. 가장 주목할 만한, 로타 바이러스 관련 어린 시절 죽음의 수는 2000년에 대략 528,000에서 2016년에 128,500에^4,,5로감소했습니다. 로타바이러스 백신은 생후 6개월까지 어린이에게 2~3회 투여되는 살아있는 감쇠 균주에서 제조됩니다. 인간 과 다른 포유류 종에서 순환하는 유전적으로 다양한 로타 바이러스 균주의 많은 수, 돌연변이 발생 및 재분류를 통해 빠르게 진화하는 능력과 결합, 어린이를 감염로 타 바이러스의 유형에 항원 변화를 초래할 수있다^6,,7,,8. 이러한 변화는 기존 백신의 효능을 약화시킬 수 있으며, 대체 또는 수정이 필요합니다.

11개의 로타바이러스 게놈 세그먼트 중 어느 한 쪽의 조작을 가능하게 하는 완전 플라스미드 기반 역유전학 시스템의 개발은 최근에^9개달성되었다. 이러한 시스템의 가용성으로, 그것은 로타 바이러스 복제 및 병인의 분자 세부 사항을 해명 할 수있게되었다, 안티 로타 바이러스 화합물에 대한 개선 된 높은 처리량 스크리닝 방법을 개발하고, 로타 바이러스 백신의 새로운 잠재적으로 더 효과적인 클래스를 만들 수 있게되었다. 로타바이러스 복제 동안, 바이러스 성 (+)RNAs는 바이러스 성 단백질의 합성을 안내 할뿐만 아니라 자손 dsRNA 게놈 세그먼트^10,,11의합성을위한 템플릿역할을합니다. 현재까지 기술된 모든 로타바이러스 역유전학 시스템은 재조합 바이러스^9,,12,,13을회수하는데 사용되는 cDNA 유래(+)RNA의 공급원으로서 포유류 세포주내로 T7 전사 벡터의 형질감염에 의존한다. 전사 벡터 내에서, 전신 바이러스 성 cDNA는 상류 T7 프로모터와 다운스트림 간염 델타 바이러스 (HDV) ribozyme 사이에 위치되어 바이러스 (+)RNA가 본격적인 5’및 3’termini를 포함하는 T7 RNA 폴리머라제에 의해 합성됩니다(그림 1A). 1세대 역유전학 시스템에서, 재조합 바이러스는 11T7(pT7) 전사 벡터로 T7 RNA 폴리머라제(BHK-T7)를 발현하는 아기 햄스터 신장 세포를 트랜스펙팅함으로써 만들어졌으며, 시미안 SA11 바이러스 균주의 독특한(+)RNA및 3개의 CMV 프로모터-구동 발현 플라스미드의 각각의 지시 합성, 조류 류바이러스 p10FAST 융합 단백질을 인코딩한 1개 및 백시니아 바이러스 D1R-D12L 캡핑 효소 복합체의 2개의 인코딩^{서브유닛.} 형질감염된 BHK-T7 세포에서 생성된 재조합 SA11 바이러스는 로타바이러스 성장을 허용하는 세포주인 MA104 세포를 감독함으로써 증폭되었다. 1세대 역유전학 시스템의 변형된 버전은 더 이상 지지^{플라스미드(12)를}사용하지 않는다고 기술되었다. 대신, 수정된 시스템은 단순히 BHK-T7 세포를 11개의 SA11 T7 전사 벡터로 트랜스펙팅함으로써 재조합 로타바이러스를 성공적으로 생성하며, 바이러스 성 공장(viroplasm) 빌딩 블록(비구조적 단백질 NSP2 및 NSP5)에 대한 벡터가 다른 벡터^{14, 15보다,15}3배 높은 수준으로 추가된다는 경고와 함께. 역유전학 시스템의 변형된 버전은 또한 로타바이러스^16,,17의인간 KU 및 Odelia 균주의 회복을 지원하는 개발되었다. 로타바이러스 게놈은 VP4^18,NSP1^9,NSP2^19,NSP3^20,,21,NSP5^22,,23에도입된 돌연변이와 함께 현재까지 생성된 재조합 바이러스와 함께 역유전학에 의한 조작이 현저하게 가능하다. 지금까지 생성된 가장 유용한 바이러스 중에는 형광 리포터 단백질(FPs)^{9,,12,,21,,24,,25를}발현하도록 설계된 바이러스가 있다.

이 간행물에서는, 우리는 우리가 SA11 로타바이러스의 재조합 긴장을 생성하기 위하여 우리의 실험실에서 사용하는 역유전학 시스템을 위한 프로토콜을 제공합니다. 당사의 프로토콜의 주요 특징은 11개의 pT7 전사 벡터(pT7/NSP2SA11 및 pT7/NSP5SA1 벡터의 3배 수준을 포함하도록 변형된 변형)와 아프리카 돼지 열바이러스(ASFV) NP868R 캡핑 효소를 코딩하는 CMV 발현 벡터를 가진 BHK-T7 세포의 병용화이다.²¹ Figure 2 우리의 손에, NP868R 플라스미드의 존재는 형질감염된 BHK-T7 세포에 의한 재조합 바이러스의 더 높은 역가의 생산으로 이어집니다. 본 공보에서는, 우리는 또한 세그먼트 7 단백질 생성물 NSP3뿐만 아니라 별도의 FP를 발현하는 재조합 바이러스가 생성될 수 있도록 pT7/NSP3SA11 플라스미드를 수정하기 위한 프로토콜을 제공한다. 이는 fp ORF(도1B)^24,,26에이어 다운스트림 2A 번역 정지-재시작 엘리먼트를 포함하는 pT7/NSP3SA11 플라스미드에서 NSP3 오픈 판독 프레임(ORF)을 재엔지니어링함으로써 달성된다. 이러한 접근법을 통해, 우리는 다양한 FPs를 발현하는 재조합 로타바이러스를 생성하였다: UnaG (녹색), mKate (원빨색), mRuby (빨강), TagBFP (청색), CFP (시안), 및 YFP (노란색)^24,,27,,28. 이러한 FP 발현 로타바이러스는 NSP3 ORF를 삭제하지 않고 만들어지므로 기능하는 바이러스 단백질의 완전한 보완을 인코딩할 것으로 예상되는 바이러스를 산출합니다.