מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי
Summary
הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.
Abstract
Rotaviruses הם אוכלוסייה גדולה ומתפתחת של וירוסים כפולה ומקוטע של RNA הגורמות לדלקת במעיים חמורה בצעירים של מינים רבים ומארחים העופות, כולל בני אדם. עם הופעתו האחרונה של רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות, זה הפך להיות אפשרי להשתמש מוטגנזה מכוונת כדי לחקור ביולוגיה רוטוירוס, לשנות ולמטב את הקיימים חיסונים רוטוירוס, ולפתח רוטוירוס רב היעד וקטורים החיסון. בדו ח זה, אנו מתארים מערכת גנטית הפוכה פשוטה המאפשרת התאוששות יעילה ואמינה של רקומביננטי rotaviruses. המערכת מבוססת על שיתוף הפעולה של T7 וקטורים המבטאת באורך מלא רוטוירוס (+) rnas ו-cmv קידוד וקטור האנזים הסגירה לתוך התאים bhk מכונן לייצר T7 RNA פולימראז (bhk-T7). רקומביננטי rotaviruses הם מוגברת על ידי זריעת יתר של תאים BHK-T7 מזוהמים עם תאים MA104, תא כליות קוף קו כי הוא מאוד מתירני עבור צמיחת וירוסים. בדו ח זה, אנו מתארים גם גישה ליצירת רקומביננטי rotaviruses המבטאים חלבון נפרד העיתונאי פלורסנט באמצעות המבוא של האלמנט להפסיק להפעיל מחדש באמצעות translational לקטע הגנום 7 (NSP3). גישה זו נמנעת ממחיקה או שינוי של כל מסגרות קריאה ויראלי פתוח, ובכך לאפשר ייצור של רקומביננטי rotaviruses השומרים חלבונים נגיפי פונקציונלי באופן מלא תוך הבעת ביטוי חלבון פלורסנט.
Introduction
Rotaviruses הם הגורמים העיקריים של דלקת במעיים חמורה אצל תינוקות וילדים צעירים, כמו גם צעירים של יונקים רבים אחרים העופות1. כחברים של המשפחה Reo, וירוסים יש מקוטע כפולה תקוע-RNA (dsRNA) הגנום. מגזרי הגנום כלולים בתוך וויאון לא עטוף שנוצר משלוש שכבות קונצנטריות של חלבון2. מבוסס על רצף וניתוח פילוגנטי של מקטעי הגנום, תשעה מינים של רוטוירוס (A-D, F-J) הוגדרו3. אלה זנים הכוללת מינים רוטוירוס הם אחראים לרוב המכריע של המחלה האנושית4. המבוא של חיסונים רוטוירוס לתוך תוכניות החיסון לילדות החל בעשור האחרון הוא בקורלציה עם הנחות משמעותיות בתמותה רוטוירוס ותחלואה. בעיקר, מספר מקרי המוות של הילדות rotavirus הקשורים ירדו מ כ 528,000 ב 2000 ל 128,500 ב 20164,5. חיסונים rotavirus מנוסחים זני לחיות החליש של הווירוס, עם 2 כדי 3 מינונים מנוהל לילדים על ידי גיל 6 חודשים. המספר הגדול של זנים רוטוירוס ירוס מגוונת גנטית במחזור בני אדם ומינים אחרים היונקים, בשילוב עם יכולתם להתפתח במהירות באמצעות מוטאוסיס והקצאה מראש, עלול להוביל לשינויים אנטיגניים בסוגים של רוטוירוס להדביק ילדים6,7,8. שינויים כאלה עלולים לערער את היעילות של חיסונים קיימים, המחייבים החלפת או שינוי שלהם.
התפתחות של מערכות גנטיקה הפוכה במלואו בסיס המאפשר מניפולציה של כל 11 מקטעי הגנום רוטוירוס הושגה רק לאחרונה9. עם הזמינות של מערכות אלה, זה הפך להיות אפשרי לפענח פרטים מולקולריים של שכפול רוטוירוס ו פתוגנזה, כדי לפתח שיפור תפוקה גבוהה שיטות ההקרנה עבור תרכובות אנטי-רוטוירוס, וכיצד ליצור מחלקות חדשות פוטנציאלי יותר יעיל של חיסונים רוטוירוס. במהלך שכפול רוטוירוס, הכתיר ויראלי (+) rnas לא רק מדריך סינתזה של חלבונים ויראלי, אלא גם לשמש כתבניות לסינתזה של צאצאי הגנום dsrna מגזרים10,11. כל רוטוירוס גנטיקה הפוכה מערכות שתוארו עד תאריך להסתמך על הT7 של שעתוק וקטורים לתוך שורות התא של היונקים כמקור cdna-נגזר (+) rnas בשימוש בשחזור רקומביננטי וירוסים9,12,13. בתוך וקטורים שעתוק, cDNAs באורך מלא ממוקמים בין היזם T7 במעלה למטה הפטיטיס דלתא וירוס (HDV) ריבוזים כגון זה ויראלי (+) RNAs מסונתז על ידי T7 RNA פולימראז המכילים אותנטי 5 ‘ ו 3 ‘-termini (איור 1A). במערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון, וירוסים רקומביננטי נעשו על ידי התינוק מצפה בתאי כליה אוגר ביטוי T7 RNA פולימראז (bhk-T7) עם 11 T7 (pT7) תמלול וקטורים, כל מכוון סינתזה של ייחודי (+) RNA של מאמץ SA11 וירוס קופיים, ושלושה cmv יזם-כונן ביטוי פלמידים, קידוד אחד החלבון reovirus p10FAST היתוך ושני חלבוניות קידוד של vaccinia וירוס D1R-D12L הסגירה אנזים מורכב9. וירוסים רקומביננטי SA11 שנוצרו בתאי bhk-T7 מזוהמים היו מוגבר על ידי זריעה יתר עם MA104 תאים, קו תא מתירני עבור צמיחה רוטוירוס. גירסה ששונתה של מערכת הגנטיקה הפוכה של הדור הראשון תוארה שכבר לא משתמשת ב-פלמידים תומכים12. במקום, המערכת ששונתה מייצרת בהצלחה רקומביננטי rotaviruses פשוט על ידי transfecting T7 תאים ב-hk עם 11 SA11 שעתוק וקטורים, עם האזהרה כי וקטורים עבור המפעל ויראלי (viroפלסטיות) אבני בניין (חלבונים לא מבניים NSP2 ו NSP5) מתווספים ברמות 3 מתקפל גבוה יותר מאשר וקטורים אחרים14,15. גרסאות ששונו של מערכת הגנטיקה הפוכה פותחו גם כי תמיכה ההתאוששות של קו האדם ו אודליה וזנים של רוטוירוס16,17. הגנום רוטוירוס היא קלה להפליא מניפולציה על ידי הפוך גנטיקה, עם רקומביננטי וירוסים שנוצרו עד היום עם מוטציות הציג לתוך VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, ו NSP522,23. בין הווירוסים השימושיים ביותר שנוצר עד כה הם אלה שעברו הנדסה לבטא חלבונים כתב פלורסנט (FPs)9,12,21,24,25.
בפרסום זה, אנו מספקים את הפרוטוקול עבור מערכת הגנטיקה הפוכה שאנו משתמשים במעבדה שלנו כדי לייצר רקומביננטי זנים של SA11 rotavirus. התכונה המפתח של הפרוטוקול שלנו היא שיתוף של התאים BHK-T7 עם 11 pT7 וקטורים (שונה לכלול רמות 3x של pT7/NSP2SA11 ו pT7/NSP5SA11 וקטורים) ו-CMV ביטוי קידוד וקטור החזירים האפריקאי (ASFV) NP868R סגירה אנזים21 (איור 2). בידינו, נוכחות של NP868R באמצע מוביל את הייצור של מגדל גבוה יותר של וירוסים רקומביננטי על ידי מנוכר bhk-T7 תאים. בפרסום זה, אנו מספקים גם פרוטוקול עבור שינוי pT7/NSP3SA11 הפלמיד כגון הרקומביננטי וירוסים ניתן ליצור כי לבטא לא רק את המוצר 7 מוצר חלבון NSP3 אלא גם FP נפרד. זה מושגת על ידי מחדש הנדסה NSP3 פתוח מסגרת הקריאה (orf) ב pT7/NSP3SA11 פלמיד להכיל במורד הזרם 2a לעצור הפעלה מחדש האלמנט ואחריו FP (איור 1b)24,26. באמצעות גישה זו, יצרנו רקומביננטי rotaviruses ביטוי FPs שונים: unag (ירוק), mkate (רחוק-אדום), mkate (אדום), tagbfp (כחול), CFP (ציאן), ו-yfp (צהוב)24,27,28. אלה וירוסים FP ביטוי זה נעשים מבלי למחוק את NSP3 ORF, ובכך וירוסים מניבים כי צפויים לקודד השלמה מלאה של התפקוד חלבונים נגיפי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במעבדה שלנו, אנו סומכים באופן שגרתי על הפרוטוקול גנטיקה הפוכה המתוארת בזאת כדי לייצר רקומביננטי SA11 rotaviruses. עם גישה זו, אנשים עם ניסיון קטן בטכניקות ביולוגיה מולקולרית או עבודה עם rotaviruses לשחזר וירוסים רקומביננטי גם בניסיון הראשון שלהם. יצרנו קרוב 100 וירוסים רקומביננטי בעקבות פרוטוקול זה, כו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענקים R03 AI131072 ו R21 AI144881, מימון הסטארט-Up של אוניברסיטת אינדיאנה, ואת קרן לורנס M.. אנו מודים לחברי מעבדת הרנטגן של המעבדה, אולריך דסלברגר, וגואידו פאפא בגין תרומותיהם הרבות והצעותיהם בפיתוח פרוטוקול הגנטיקה הפוכה.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
