Оценка возрастных фагоцитных способности взрослых Drosophila меланогастер гемоцитов с помощью In Vivo Фагоцитоз Анализа

1. Собирать и стареть дрозофилы Для генерации же в возрасте F1 мух для тестирования фагоцитоза, добавить 5-10 девственных женщин и 5 мужчин соответствующих генотипов на флакон, содержащий свежие продукты питания мухи. Мы используем кукурузную мелиору агар на основе пищи20, но метод должен работать независимо от типа диеты мухи выращиваются на. Для этого эксперимента мы использовали Hemese (Он)-GAL4; UAS-GFP летит, чтобы пометить гемоциты генетически.ПРИМЕЧАНИЕ: Больше мух могут быть использованы, но некоторые линии D. melanogaster не может спариваться или размножаться хорошо, когда переполненность, и переполненность может иметь неблагоприятные последствия для развития личинок21 и фагоцитоз. Поддерживайте мухи в желаемых экспериментальных условиях. Для этого эксперимента, поддерживать He-GAL4; UAS-GFP летает при 24 градусах Цельсия. Разрешить взрослым мух спариваться в течение недели, а затем удалить взрослых. F1 мухи будут собраны из этих флаконов после экзпиона для экспериментального использования. Собирайте девственных мух в течение недели, или до тех пор, пока не будет собрано нужное количество мух. Девственницы не требуются; однако спаривание может повлиять на иммунный ответ. Если F1 мухи должны быть проверены как девственницы, отдельные мужчины и женщины в течение 8 часов после эквразиона и поддерживать в отдельных флаконах для предотвращения спаривания. Соберите достаточно мух, чтобы позволить оценку фагоцитоза, по крайней мере 10 мух на генотип / лечение / пол в возрасте. Если старение летит до одной недели, собрать по крайней мере 50 мух в общей сложности, или 20 мух в состоянии лечения для каждой частицы, либо фтор-частицы или рН чувствительных частиц, которые должны быть введены. Это обеспечит как минимум 10 мух для анализа во время эксперимента. Если старение летит более чем на 3 недели, собрать по крайней мере 100-150 мух в общей сложности, или 50-75 мух на лечение условие, чтобы обеспечить Есть достаточно мух для измерения фагоцитоза. Когда старение летит в лаборатории, мы обычно используем клетки насекомых поддерживается на 24 градусов по Цельсию в 12:12 L:D условия, и изменить пищу через день. Если флаконы используются вместо клеток, кончик летит в новые флаконы каждые 3-5 дней, в зависимости от состояния пищи во флаконе. Количество необходимых мух будет зависеть от того, как в конце возраста будет анализироваться фагоцитоз, и возрастных показателей выживаемости этого генотипа в определенном экологическом состоянии. Если молодые и пожилые мухи будут оценены, план соответственно так, что 1-недельный и пожилой мух будет введен в тот же день. Это позволит свести к минимуму различия в концентрации частиц между экспериментами и обеспечит, чтобы влияние возраста на фагоцитическое измерение не было смешано с эффектом дня проведения анализа. Дом собранных мух при 24 кк, пока они не 5-7 дней, или поддерживать мух до нужного возраста. 2. Подготовка флуоресцентно помеченных частиц Восстановление тепло-убитых E. coli фтор-частиц или рН чувствительных частиц кишечной палочки к концентрации запасов 20 мг / мл или 1 мг / мл, соответственно. Другие бактерии доступны для использования, которые могут быть более подходящими для некоторых экспериментов, но ссылаются на инструкции производителя для соответствующих концентраций запасов. Для фтор-частиц добавьте 990 мл 1x PBS (рН 7,4) или предпочтительный буфер и 10 мл 2 мл (20%) натрия азид. Вихрь для смешивания.ПРИМЕЧАНИЕ: Азид натрия является консервантом, который может быть опущен; однако частицы, приготовленные без азида натрия, не длятся так долго. Фтор-частицы должны быть использованы в течение 24 часов и рН чувствительных частиц должны быть использованы в течение 7 дней. Для чувствительных частиц рН добавьте 1 980 л 1x PBS (рН 7,4) или предпочтительный буфер и 20 мл 2 мл (20%) натрия азид. Вихрь для смешивания. Сделайте несколько одноразовых 20 аликотов в 1,5 мл микроцентрифуговых труб. Храните фтор-частицы при -20 градусов по Цельсию до года, а чувствительные частицы рН при 4 градусах Цельсия в течение 6 месяцев, защищенные от света. В день инъекций перед употреблением удалите азид натрия из частиц. Для этого центрифужирует частицы в течение 5 минут при температуре 15 000 х г. Удалите супернатант и мыть частицы дважды путем повторного регустроя в 50 мл 1x PBS или предпочтительного буфера, и центрифуги в течение 5 минут при 15000 х г. После второй стирки удалите супернатант и повторно активированные частицы в 100 мл 1x PBS или предпочтительный буфер. Держите раствор в трубке и свести к минимуму воздействие света на протяжении всего эксперимента. После удаления азида натрия используйте фтор-частицы в пределах 24 ч и используйте чувствительные частицы рН, используемые в течение 5-7 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: В наших предыдущих экспериментах, мы обнаружили, что эта концентрация частиц при условии, подсчитанное количество фагоцитных событий и что количество частиц, доступных для фагоцитоза гемоцитов не ограничивает17. Тем не менее, пользователи этого протокола могут захотеть сравнить результаты с использованием других концентраций, чтобы убедиться, что существует достаточное количество частиц, доступных для фагоцитоза гемоцитов в условиях их экспериментов. Если азид натрия был опущен, разбавить частицы 1:5 в том же буфере, с помощью которого были подготовлены частицы, для инъекций. Добавьте к частицам каплю (10 мл) зеленого пищевого красителя. Это упрощает работу мух. 3. Введите мух Подготовка стеклянных игл для инъекций. Вытяните стеклянные иглы с помощью пипетки шкив. Установите пипетки шкив нагреватель до 55 градусов по Цельсию и соленоид до 45. Используйте только иглы, предоставляемые инжектором, так как не гарантируется, что другие иглы будут работать с такой же точностью. Заполните стерильный шприц 1 мЛ с минеральным маслом, и прикрепите 30 калибровочных подкожных (G) иглы, предоставляемые с нано-инжектором. Backfill вытащил капиллярной иглы, вставив 30 G иглы в тупой конец вытащил стеклянной иглы и заполнить с минеральным маслом. Медленно удалите 30 G иглы, гарантируя Есть нет пузырьков воздуха по всей иглы, так как это может привести к неточным объемам инъекций. Инжектор не будет работать должным образом без заполнения иглы. Используя щипцы, разорвать кончик иглы, чтобы создать отверстие, чтобы выброс раствора. Соберите нано-инжектор.ПРИМЕЧАНИЕ: Другие инжекторы могут быть использованы. Метод, описанный ниже, применяется к нано-инжектору. Для других инжекторов, обратитесь к руководству пользователя для инструкций. Установите инжектор к нужному объему (между 46 nL и 69 nL). Удалите collet и поместите уплотнение O-кольца, белый прокладка с отступом лицом вверх, чтобы получить задний конец иглы, и больше O-кольцо на металлический поршень, в этом порядке. Прикрепить collet без затягивать его. Вставьте металлический поршень в тупой конец заполненной маслом стеклянной иглы. Аккуратно нажмите иглу вниз, вставив его в большую O-кольцо. Затяните collet до безопасного.ПРИМЕЧАНИЕ: Если металлический поршень не простирается мимо коллеги, нажмите и удерживайте ‘EMPTY’ до тех поршень видна. Это облегчает обеспечение поршень вставляется в иглу. Нажмите и удерживайте ‘EMPTY’ до тех пор, пока инжектор не пойдит звуковой сигнал. Это выбрасывает большую часть минерального масла из иглы, оставляя небольшой объем масла, чтобы выступать в качестве барьера между двумя жидкостями, а также удаляет пузырьки воздуха. Заполните иглу либо фтор-частицами, либо чувствительными частицами рН, вставив кончик стеклянной иглы в трубку микроцентрифуги, содержащую подготовленные частицы. Нажмите и удерживайте ‘FILL’ до тех пор, пока инжектор не пойдит звуковой сигнал. Инъекции Передача мух, которые должны быть введены в пустой флакон. Иммобилизируйте мух, поместив флакон во льду. CO2 также может быть использован для обездвиживания мух. Однако, обратите внимание, что при использовании рН чувствительных частиц, повышенные уровни CO2 может искусственно подкислять любые буферы, используемые и может поднять фоновую флуоресценцию. Введите мух в стерноплеуральной пластины грудной клетки(рисунок 1A). Инъекция является успешным, если зеленый краситель рассматривается вдаваясь в летать (Рисунок 1B). Если муха не зеленеет, убедитесь, что игла не засоряется.ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, мухи могут быть введены в живот, но держать место инъекции последовательной во всех экспериментах. Место вводили мухи в новый пищевой флакон, отмечая время, что первая и последняя муха была введена. Чтобы свести к минимуму экспериментальную ошибку из-за количества времени, необходимого для завершения инъекций, завершить инъекции своевременно. На практике, это должно занять не более 10 минут, чтобы ввести один набор мух. Положите флакон на бок, пока все мухи не оправились, чтобы предотвратить мухи от застрять в пище. Разрешить мухам восстанавливаться в течение 60-90 мин, в зависимости от экспериментальных условий. Здесь было использовано 60-минутное время восстановления. Обратите внимание, что этот диапазон времени восстановления был оптимальным для подсчета фагоцитных событий в экспериментальных условиях в Horn et al. study17. Однако, при некоторых условиях, это может быть слишком долго, чтобы обнаружить тонкие различия в фагоцитозе между группами лечения. Возможно, было бы полезно провести эксперименты на времени, как это было сделано ранее17, чтобы определить время восстановления, которое покажет максимальные различия между контролем и экспериментальными результатами. Независимо от времени восстановления выбран, держать это последовательно во всех экспериментальных методов лечения. При инъекциях с фтор-частицами и рН чувствительных частиц в тот же день, используйте новую иглу для каждого раствора. Не впрыскивайте отдельных мух с обеими частицами, если они оба флуоресцируют красный, так как результат не будет различать два аспекта фагоцитоза, связывания частиц / поглощения против включения частиц в фагосоме. 4. Рассекирование спинного сосуда После того, как мухи восстановились за 60-90 мин, перенесите всех живых мух на пустой флакон и обездвижите на льду. Перенесите одну муху за один раз на силиконовую пластину вскрытия эластомера.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка вскрытия пластин по крайней мере 1-недельный до использования, если лечение при комнатной температуре. Для этого приготовьте эластомер и вылейте его в 33 мм х 10 мм чашку Петри, заполнив блюдо примерно на полпути. Аккуратно коснитесь блюда на плоской поверхности, чтобы свести к минимуму пузырьки воздуха. Пусть тарелки сидят при комнатной температуре, спокойно, по крайней мере неделю. Под рассекающим стерео микроскопом, ориентируйте муху вентральной стороной вверх. Использование насекомых булавки, контактный летать на тарелку, вставив один штифт через грудную клетку, а другой контактный через самый задний конец живота, вблизи гениталий (Рисунок 2A). Это может быть полезно, чтобы сократить булавки пополам, прежде чем прижимая образец, чтобы не препятствовать вскрытию. Повторите с до 10 мух на вскрытии пластины.ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно: Удалите крылья и ноги, прежде чем прижимая летать к пластине. Это поможет предотвратить пузырь, образующийся вокруг мухи, когда средства массовой информации добавляется. После того, как все мухи были прижаты к пластине, добавьте достаточно средств вскрытия, чтобы покрыть мух (1 мЛ) с помощью передачи pipet. Используя щипцы или ножницы кутикулы, снимите голову. Используя ножницы кутикулы, сделайте два горизонтальных разреза: один прямо над задней булавкой в животе, а другой на самом передней части живота, где грудной клетки и живота встречаются (Рисунок 2B, C). На рисунке 2,голова была оставлена нетронутой для уточнения ориентации. Сделайте вертикальный разрез, соединив два горизонтальных разреза (три разреза напоминают букву I). Это откроет брюшную полость(Рисунок 2D). Используя щипцы, удалить внутренние органы и ткани, избегая спинного сосуда. Если не беспокоит, прозрачный спинной сосуд часто можно увидеть пульсирующий вблизи переднего конца живота. Дополнительные булавки могут быть использованы для контактный открыть вновь сократить концы кутикулы (Рисунок 2E, F). Используя ножницы кутикулы, удалите грудную клетку. Кроме того, грудная клетка может быть удалена перед монтажом расчлененных кутикул и спинных сосудов на слайде микроскопа. Повторите с оставшимися мухами.  препарировать мух своевременно, чтобы свести к минимуму возможные колебания в фагоцитии скорости. После того, как все мухи были вскрыты, оставьте кутикулы с прикрепленным спинным сосудом, прижатым к пластине. Весь шаг 5 будет осуществляться в вскрытии пластины. Это предотвратит повреждение или случайное отбрасывание кутикулы между ступенями. 5. Фиксация и окрашивание Исправить расчлененные кутикулы с прикрепленным спинным сосудом в 4% параформальдегиде (ПФА). Используя новый одноразовый трансфер для каждого шага, откажитесь от средств вскрытия и замените 1 мл 4% PFA. На протяжении фиксации и окрашивания, держать вскрытия защищены от света как можно больше. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин с качания при 20 об/мин. Не позволяйте вскрытия сидеть в фиксатор более 20 минут, так как это может начать повредить ткани. Вымойте кутикулы 2x в 1x PBS – 0,1% Tween (PBST). Удалить фиксатор и заменить 1 мл 1x PBST. Вымойте при комнатной температуре в течение 15 мин с качания. Повторите 1x.ПРИМЕЧАНИЕ: Расчлененная, фиксированная ткань может храниться при 4 градусах Цельсия, в течение 3 дней, защищенных от света, после первой стирки, заменив стирку свежим PBST. Не храните фиксированные ткани, если антитела будут использоваться. Антитела следует использовать со свежей тканью для достижения наилучших результатов. Дополнительно: окрашивание антител. Антитела могут быть использованы для четкого визуализации спинной сосуд четко (Рисунок 3), или для обнаружения гемоцитов конкретных маркеров. Это может обеспечить только клетки вдоль спинного сосуда подсчитываются или пометить мембрану гемоцитов. Удалить вторую стирку, добавить первичные антитела при соответствующем разбавлении. Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию, с качания. Удалить первичные антитела, и мыть дважды с PBST в течение 15 мин с качания. Добавьте флуоресцентное вторичное антитело. Мы рекомендуем зелено-флуоресцентное антитело, чтобы оно не заслонять флуоресцентные частицы. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч, с качалкой. Удалить вторичные антитела, мыть дважды в течение 15 минут каждый с PBST. Пятно с DAPI. Удалите окончательную стирку и замените 1 мЛ DAPI, разбавленного в PBST (1:1000). Пятно в течение 20 мин с качания при комнатной температуре. Удалить DAPI и промыть 2x (повторите шаг 5.2). Замените финальную стирку на свежую 1x PBST.ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи могут храниться при 4 градусах Цельсия, в течение 3 дней, защищенных от света, после первой стирки, заменив стирку свежим PBST. 6. Монтаж кутикулы на слайдах микроскопа и изображения Приготовьте расчлененные кутикулы. Под рассекающим стереомикроскопом отрежьте избыток кутикулы, которая может помешать визуализации. Используя щипцы, перенесите кутикулы с прикрепленным спинным сосудом в микроцентрифугную трубку 1,5 мл, содержащую 70% глицерол. Размещение кутикулы в глицерол поможет удалить PBST и позволяет более четкое изображение во время визуализации. Гора кутикулы на слайд микроскопа. Добавьте несколько капель 70% глицерола в слайд микроскопа. Используя щипцы, удалить кутикулы из глицерол трубки и место в глицерол на слайде. Под рассекающим стерео микроскопом используйте щипцы для ориентации кутикулы брюшной стороны вверх, обеспечивая видна спинная сосуд. Темный пигмент кутикулы будет лицом вниз. Добавить дополнительную каплю глицерол, если это необходимо. Это помогает предотвратить пузырьки воздуха и позволяет более четкое изображение. Аккуратно поместите крышку над кутикулами и краями уплотнения с лаком для ногтей. Дайте высохнуть в течение 10-15 мин, прежде чем продолжить. Изображение мух немедленно или хранить в светонепроницаемой коробке при 4 градусов по Цельсию. Изображение спинного сосуда. Используя флуоресцентный микроскоп, используйте систему структурных помех для генерации оптических секций спинного сосуда. В качестве альтернативы можно использовать конфокальный микроскоп, который может обеспечить дополнительную точность. Получите изображения спинного сосуда с помощью 20-х объективного и предпочтительного программного обеспечения для визуализации. Добавьте 10-мм бар масштаба, и правильно этикетки и сохранить изображения, как tiff файлов(Рисунок 4)или желаемого формата.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество полученных изображений с стеком может варьироваться между вскрытиями и зависит от того, насколько хорошо был рассечен спинной сосуд, и от желаемого размера шага между изображениями. Здесь размер шага был установлен до 0,49 мм. Это число может варьироваться от 3 до 40 изображений на стек в нашем опыте. 7. Анализ изображений Количественная оценка флуоресцентных событий с помощью ImageJ. Открыть изображения и сложить их: Изображение – Стеки – Изображения в стек. Подсчитайте только флуоресцентные сигналы размером 1 мм в пределах 10 мм, сосредоточенные на DAPI-позитивном ядре, нажав на каждое событие, по крайней мере, от 10 клеток на муху, от по крайней мере 10 мух на место ввода частицы: Плагины и анализ à и cell Counter Notice (Рисунок 5A). Инструмент счетчика ячейки присваивает другой цвет каждой отслеживаемой ячейке, с цветной точкой, которая соответствует каждому флуоресцентному событию, нажатому в этой ячейке. Чтобы перечислить позицию счетчика и стека, связанную с каждой точкой, нажмите ‘m’ или выберите меру под вкладкой «Анализ» или для отображения количества событий, подсчитанных в каждой ячейке в таблице результатов, нажмите «alt qy»(рисунок 5B). Передача ячейки рассчитывается в электронную таблицу, которая будет использоваться для статистического анализа. Выполните статистический анализ. Проанализируйте различия в фагоцитных событиях с помощью либо фиксированных эффектов ANOVA, либо смешанной модели nested ANOVA. Смешанные модели могут быть использованы для проверки основных фиксированных эффектов возраста и генотипа и случайного эффекта лиц, вложенных в каждый генотип17.ПРИМЕЧАНИЕ: Следователи должны быть строгими в тестировании предположения любой статистической процедуры, используемой для анализа данных.