Évaluation de la capacité phagocytique spécifique à l’âge des hémocytes adultes de Drosophila melanogaster à l’aide d’un test de phagocytose in vivo

1. Recueillir et l’âge Drosophila Pour générer les mêmes mouches F1 âgées pour tester la phagocytose, ajoutez 5 à 10 femelles vierges et 5 mâles des génotypes appropriés à un flacon contenant de la nourriture fraîche pour mouches. Nous utilisons une mélasse de maïs agar à base d’aliments20, mais la méthode devrait fonctionner quel que soit le type de régime alimentaire sur lequel les mouches sont élevés. Pour cette expérience, nous avons utilisé Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP vole pour étiqueter les hémocytes génétiquement.REMARQUE : Plus de mouches peuvent être utilisées, mais certaines lignes de D. melanogaster peuvent ne pas s’accoupler ou se reproduire bien lorsqu’elles sont surpeuplées, et la surpopulation peut avoir des effets néfastes sur le développement larvaire21 et la phagocytose. Maintenir les mouches dans les conditions expérimentales souhaitées. Pour cette expérience, maintenez He-GAL4; UAS-GFP vole à 24 °C. Laissez les mouches adultes s’accoupler pendant une semaine, puis retirez les adultes. Les mouches F1 seront ensuite recueillies à partir de ces flacons après l’éclosion pour une utilisation expérimentale. Recueillir les mouches vierges tout au long de la semaine, ou jusqu’à ce que le nombre souhaité de mouches sont recueillies. Les vierges ne sont pas nécessaires; cependant, l’accouplement peut avoir un impact sur la réponse immunitaire. Si les mouches F1 doivent être testées en tant que vierges, séparer les mâles et les femelles dans les 8 heures suivant l’éclosion et les entretenir dans des flacons séparés pour prévenir l’accouplement. Recueillir suffisamment de mouches pour permettre l’évaluation de la phagocytose chez au moins 10 mouches par génotype/traitement/sexe par âge. Si le vieillissement des mouches à une semaine, recueillir au moins 50 mouches au total, ou 20 mouches par condition de traitement pour chaque particule, soit fluoro-particules ou particules sensibles au pH, à injecter. Cela permettra d’assurer un minimum de 10 mouches à l’essai au moment de l’expérience. Si le vieillissement vole à plus de 3 semaines, recueillir au moins 100-150 mouches au total, ou 50-75 mouches par condition de traitement pour s’assurer qu’il ya suffisamment de mouches disponibles pour mesurer la phagocytose. Lorsque le vieillissement des mouches dans le laboratoire, nous utilisons généralement des cages d’insectes maintenues à 24 °C en 12:12 L:D conditions, et de changer la nourriture tous les deux jours. Si des flacons sont utilisés au lieu de cages, la pointe vole dans de nouveaux flacons tous les 3-5 jours, selon l’état de la nourriture dans le flacon. Le nombre de mouches nécessaires dépendra de la façon dont la phagocytose d’âge sera analysée tardivement, et les taux de survie spécifiques à l’âge de ce génotype dans un état environnemental particulier. Si les mouches jeunes et âgées sont évaluées, prévoyez en conséquence afin que les mouches âgées d’une semaine et âgées soient injectées le même jour. Cela permettra de minimiser les variations de la concentration des particules entre les expériences et de s’assurer que l’effet de l’âge sur la mesure phagocytique n’est pas confondu avec l’effet du jour où l’essai a été effectué. Loger les mouches recueillies à 24 °C jusqu’à ce qu’elles aient entre 5 et 7 jours, ou maintenir les mouches à l’âge désiré. 2. Préparer des particules fluorescentes Reconstituer les particules fluoro-fluoro-coli tuées par la chaleur ou les particules sensibles au pH E. coli à une concentration de stock de 20 mg/mL ou 1 mg/mL, respectivement. D’autres bactéries sont disponibles pour une utilisation qui peut être plus approprié pour certaines expériences, mais se réfèrent aux instructions du fabricant pour les concentrations appropriées de stock. Pour les particules fluoro, ajouter 990 μL de 1x PBS (pH 7,4) ou tampon préféré et 10 μL de 2 mM (20%) azide de sodium. Vortex à mélanger.REMARQUE : L’azide de sodium est un agent de conservation qui peut être omis; cependant, les particules préparées sans azide de sodium ne durent pas aussi longtemps. Les particules fluoro doivent être utilisées dans les 24 heures et les particules sensibles au pH doivent être utilisées dans les 7 jours. Pour les particules sensibles au pH, ajouter 1 980 μL de 1x PBS (pH 7,4) ou tampon préféré et 20 μL de 2 mM (20 %) azide de sodium. Vortex à mélanger. Faire plusieurs aliquots à usage unique de 20 μL dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 m L. Stockez les particules fluoro à -20 °C pendant un an et les particules sensibles au pH à 4 °C pendant jusqu’à 6 mois, à l’abri de la lumière. Le jour des injections, retirer l’azide de sodium des particules avant utilisation. Pour ce faire, centrifugez les particules pendant 5 min à 15 000 x g à température ambiante. Retirez le supernatant et lavez les particules deux fois en résuspendant dans 50 μL de 1x PBS ou tampon préféré, et centrifuge pendant 5 min à 15 000 x g. Après le deuxième lavage, retirez les particules supernatantes et resuspendez dans 100 μL de 1x PBS ou tampon préféré. Gardez la solution dans le tube et minimisez l’exposition à la lumière tout au long de l’expérience. Une fois l’azide de sodium éliminé, utilisez des particules fluoro dans un rayon de 24 h et utilisez des particules sensibles au pH utilisées dans les 5 à 7 jours.NOTE : Dans nos expériences précédentes, nous avons constaté que cette concentration de particules fournissait des nombres dénombrements d’événements phagocytiques et que le nombre de particules disponibles pour la phagocytose par les hémocytes ne limitait pas17. Cependant, les utilisateurs de ce protocole peuvent vouloir comparer les résultats en utilisant d’autres concentrations pour s’assurer qu’il y a un nombre suffisant de particules disponibles pour la phagocytose par les hémocytes dans les conditions de leurs expériences. Si l’azide de sodium a été omis, diluer les particules 1:5 dans le même tampon que les particules ont été préparés avec, pour les injections. Ajoutez une goutte (~10 μL) de colorant alimentaire vert aux particules. Il est ainsi plus facile de s’assurer que les mouches ont été injectées. 3. Injecter les mouches Préparer des aiguilles en verre pour les injections. Tirez des aiguilles en verre à l’aide d’un puller de pipette. Réglez le chauffe-pousse pipette à 55 °C et le solénoïde à 45. Utilisez uniquement les aiguilles fournies avec l’injecteur, car il n’est pas garanti que d’autres aiguilles fonctionneront avec la même précision. Remplissez une seringue stérile de 1 mL d’huile minérale et attachez l’aiguille hypodermique (G) de calibre 30, fournie avec le nano-injecteur. Remplir l’aiguille capillaire tirée en insérant l’aiguille de 30 G dans l’extrémité émoussée de l’aiguille en verre tiré et remplir d’huile minérale. Retirez lentement l’aiguille de 30 G, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air dans toute l’aiguille, car cela peut causer des volumes d’injection inexacts. L’injecteur ne fonctionnera pas correctement sans remblayer l’aiguille. À l’aide de forceps, détachez le bout de l’aiguille pour créer une ouverture pour permettre l’éjection de la solution. Assembler le nano-injecteur.REMARQUE : D’autres injecteurs peuvent être utilisés. La méthode décrite ci-dessous s’applique au nano-injecteur. Pour les autres injecteurs, consultez le manuel d’utilisation pour obtenir des instructions. Réglez l’injecteur sur le volume souhaité (entre 46 nL et 69 nL). Retirez le collet et placez l’anneau O d’étanchéité, l’espaceur blanc avec l’indentation orientée vers le haut pour recevoir l’extrémité arrière de l’aiguille, et le plus grand O-anneau sur le piston en métal, dans cet ordre. Rattacher le collet sans le serrer. Insérez le piston métallique dans l’extrémité émoussée de l’aiguille en verre remplie d’huile. Poussez doucement l’aiguille vers le bas, en l’insérant dans le plus grand O-ring. Serrer le collet jusqu’à ce qu’il soit sécurisé.REMARQUE : Si le piston métallique ne s’étend pas au-delà du collet, appuyez et maintenez ‘ EMPTY jusqu’à ce que le piston soit visible. Il est ainsi plus facile de s’assurer que le piston est inséré dans l’aiguille. Appuyez et maintenez ‘EMPTY’ jusqu’à ce que l’injecteur bipe. Cela éjecte la majeure partie de l’huile minérale de l’aiguille, laissant un petit volume d’huile pour agir comme une barrière entre les deux liquides, ainsi que supprime les bulles d’air. Remplissez l’aiguille de particules fluoro-particules ou de particules sensibles au pH en insérant la pointe de l’aiguille de verre dans le tube de microcentrifuge contenant les particules préparées. Appuyez et maintenez ‘ FILL’ jusqu’à ce que l’injecteur bipe. Injections Transférez les mouches qui doivent être injectées dans une fiole vide. Immobiliser les mouches en plaçant la fiole dans la glace. Le CO2 peut également être utilisé pour immobiliser les mouches. Toutefois, notez que, lors de l’utilisation de particules sensibles au pH, des niveaux élevés de CO2 peuvent acidifier artificiellement tous les tampons utilisés et peuvent élever la fluorescence de fond. Injecter les mouches dans la plaque sternopleural du thorax (Figure 1A). L’injection est réussie si on voit des colorants verts entrer dans la mouche (Figure 1B). Si la mouche ne passe pas au vert, assurez-vous que l’aiguille n’est pas obstruée.REMARQUE : Alternativement, les mouches peuvent être injectées dans l’abdomen, mais gardez le site d’injection cohérent dans toutes les expériences. Placez les mouches injectées dans un nouveau flacon alimentaire, en notant l’heure à laquelle la première et la dernière mouche ont été injectées. Pour minimiser les erreurs expérimentales dues au temps qu’il faut pour effectuer les injections, effectuez les injections en temps opportun. Avec la pratique, il ne faut pas plus de 10 min pour injecter un ensemble de mouches. Déposer le flacon sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient rétablies, afin d’éviter que les mouches ne restent coincées dans la nourriture. Laisser les mouches se rétablir pendant 60-90 min, selon les conditions expérimentales. Ici, un temps de récupération de 60 minutes a été utilisé. Notez que cette plage de temps de récupération était optimale pour compter les événements phagocytiques dans les conditions expérimentales de l’étude Horn et coll.17. Cependant, dans certaines conditions, cela peut être trop long pour détecter des différences subtiles dans la phagocytose entre les groupes de traitement. Il peut être utile d’effectuer des expériences de cours de temps comme cela a été fait précédemment17 pour déterminer le temps de récupération qui révélera des différences maximales entre le contrôle et les résultats expérimentaux. Quel que soit le temps de récupération choisi, gardez cette cohérence dans tous les traitements expérimentaux. Si vous injectez des particules fluoro-particules et des particules sensibles au pH le même jour, utilisez une nouvelle aiguille pour chaque solution. N’injectez pas les mouches individuelles avec les deux particules si elles fluorent toutes les deux le rouge, puisque le résultat ne ferait pas de différence entre les deux aspects de la phagocytose, liaison/engloutissement des particules par rapport à l’inclusion de particules dans le phagosome. 4. Disséquer le récipient dorsal Une fois que les mouches se sont rétablies pendant 60-90 min, transférez toutes les mouches vivantes vers une fiole vide et immobilisez-les sur la glace. Transférer une mouche à la fois sur une plaque de dissection d’élastomère en silicone.REMARQUE : Préparer les plaques de dissection au moins 1 semaine avant l’utilisation, si vous le guérissez à température ambiante. Pour ce faire, préparer l’élastomère et le verser dans une boîte de Pétri de 33 mm x 10 mm, en remplissant le plat environ à mi-chemin. Appuyez doucement sur le plat sur une surface plane pour minimiser les bulles d’air. Laisser reposer les assiettes à température ambiante, sans être dérangées, pendant au moins une semaine. Sous un microscope stéréo disséquant, orientez le côté ventral de mouche vers le haut. À l’aide d’épingles d’insectes, épingler la mouche sur la plaque en insérant une goupille à travers le thorax et une autre broche à travers l’extrémité la plus postérieure de l’abdomen, près des organes génitaux (Figure 2A). Il peut être utile de couper les broches en deux avant d’épingler le spécimen afin de ne pas obstruer la dissection. Répéter avec jusqu’à 10 mouches par plaque de dissection.REMARQUE : Facultatif : Retirez les ailes et les jambes avant d’épingler la mouche sur la plaque. Cela aidera à empêcher une bulle de se former autour de la mouche lorsque le média est ajouté. Une fois que toutes les mouches ont été épinglées à la plaque, ajoutez suffisamment de support de dissection pour couvrir les mouches (~1 mL) à l’aide d’un pipet de transfert. À l’aide de forceps ou de ciseaux de cuticule, retirez la tête. À l’aide de ciseaux de cuticule, faire deux incisions horizontales: l’une directement au-dessus de la broche postérieure dans l’abdomen, et l’autre à l’extrémité la plus antérieure de l’abdomen, où le thorax et l’abdomen se rencontrent (Figure 2B, C). Dans la figure 2, la tête a été laissée intacte pour clarifier l’orientation. Faire une incision verticale, reliant les deux incisions horizontales (les trois coupes ressemblent à la lettre I). Cela ouvrira la cavité abdominale (Figure 2D). À l’aide de forceps, enlever les organes internes et les tissus, en évitant le vaisseau dorsal. S’il n’est pas perturbé, on peut souvent voir le récipient dorsal transparent pulser près de l’extrémité antérieure de l’abdomen. Des broches supplémentaires peuvent être utilisées pour épingler les extrémités nouvellement coupées de la cuticule (Figure 2E, F). À l’aide de ciseaux de cuticule, retirer le thorax. Alternativement, le thorax peut être enlevé avant de monter les cuticules disséquées et le récipient dorsal sur une lame de microscope. Répéter avec les mouches restantes.  disséquer les mouches en temps opportun, afin de minimiser les variations possibles du taux phagocytique. Une fois que toutes les mouches ont été disséquées, laissez les cuticules avec le récipient dorsal attaché épinglé à la plaque. Toute l’étape 5 sera effectuée dans la plaque de dissection. Ceci empêchera d’endommager ou de jeter accidentellement des cuticules entre les étapes. 5. Fixation et coloration Fixer les cuticules disséquées avec le récipient dorsal attaché dans 4% de paraformaldéhyde (PFA). À l’aide d’un nouveau pipet de transfert jetable pour chaque étape, jetez le support de dissection et remplacez-le par 1 mL de 4 % de PFA. Tout au long de la fixation et de la coloration, garder les dissections protégées de la lumière autant que possible. Incuber à température ambiante pendant 15 min avec bascule à 20 tr/min. Ne laissez pas les dissections s’asseoir dans fixatif pendant plus de 20 min, car cela pourrait commencer à endommager le tissu. Laver les cuticules 2x en 1x PBS + 0,1% Tween (PBST). Retirez le fixatif et remplacez-le par 1 mL de 1x PBST. Laver à température ambiante pendant 15 min avec le balancement. Répétez 1x.REMARQUE : Les tissus disséqués et fixes peuvent être stockés à 4 °C, jusqu’à 3 jours, protégés de la lumière, après le premier lavage en remplaçant le lavage par du PBST frais. Ne stockez pas de tissus fixes si des anticorps sont utilisés. Les anticorps doivent être utilisés avec des tissus frais pour obtenir de meilleurs résultats. Facultatif : Coloration d’anticorps. Les anticorps peuvent être utilisés pour visualiser clairement le vaisseau dorsal(figure 3)ou pour détecter des marqueurs spécifiques aux hémocytes. Cela peut garantir que seules les cellules le long du récipient dorsal sont comptées ou pour marquer la membrane des hémocytes. Retirer le deuxième lavage, ajouter l’anticorps primaire à la dilution appropriée. Incuber toute la nuit à 4 °C, à bascule. Retirer l’anticorps primaire et laver deux fois avec le PBST pendant 15 min avec le balancement. Ajouter un anticorps secondaire fluorescent. Nous recommandons un anticorps vert-fluorescent afin qu’il n’obscurcisse pas les particules fluorescentes. Incuber à température ambiante pendant 2 h, à bascule. Retirer l’anticorps secondaire, laver deux fois pendant 15 min chacun avec PBST. Tache avec DAPI. Retirer le lavage final et remplacer par 1 mL de DAPI dilué dans PBST (1:1000). Tacher pendant 20 min avec bascule à température ambiante. Retirez le DAPI et lavez 2x (répétez l’étape 5.2). Remplacer le lavage final par un pbst 1x frais.REMARQUE : Les mouches peuvent être stockées à 4 °C, jusqu’à 3 jours, protégées de la lumière, après le premier lavage en remplaçant le lavage par du PBST frais. 6. Montage de cuticules sur des lames de microscope et d’imagerie Préparer des cuticules disséquées. Sous le stéréomicroscope disséquant, couper l’excès de cuticule qui pourrait interférer avec l’imagerie. À l’aide de forceps, transférer les cuticules avec le récipient dorsal attaché dans un tube de microcentrifuge de 1,5 m L contenant 70 % de glycérol. Placer les cuticules dans le glycérol aidera à supprimer PBST et permet une image plus claire pendant l’imagerie. Monter les cuticules sur la lame du microscope. Ajouter quelques gouttes de glycérol à 70% à une lame de microscope. À l’aide de forceps, retirer les cuticules du tube de glycérol et placer dans le glycérol sur la lame. Sous le microscope stéréo disséquant, utilisez des forceps pour orienter les cuticules côté ventral vers le haut, en veillant à ce que le récipient dorsal soit visible. Le pigment plus foncé de la cuticule sera face vers le bas. Ajouter une goutte supplémentaire de glycérol, si nécessaire. Cela permet de prévenir les bulles d’air et permet une image plus claire. Placez délicatement un couvercle sur les cuticules et sceller les bords avec du vernis à ongles. Laisser sécher de 10 à 15 min avant de procéder. Imagez immédiatement les mouches ou rangez-les dans une boîte à l’épreuve de la lumière à 4 °C. Image du vaisseau dorsal. À l’aide d’un microscope fluorescent, utilisez le système d’interférence structurale pour produire des sections optiques du récipient dorsal. Un microscope confocal peut alternativement être utilisé qui peut fournir une précision supplémentaire. Obtenez des images de la pile Z du vaisseau dorsal à l’aide d’un logiciel d’imagerie objectif 20x et préféré. Ajoutez une barre d’échelle de 10 mm et étiquetez et enregistrez correctement les images sous forme de fichiers tiff (figure 4) ou de format souhaité.REMARQUE : Le nombre d’images de la pile Z obtenues peut varier entre les dissections et dépend de la façon dont le vaisseau dorsal a été disséqué, et de la taille d’étape souhaitée entre les images. Ici, la taille de l’étape a été réglée à 0,49 mm. Ce nombre peut varier de 3 à 40 images par pile dans notre expérience. 7. Analyser les images Quantifier les événements fluorescents à l’aide de ImageJ. Ouvrez les images et empilez-les : Image à Stacks à Images to Stack. Comptez uniquement les signaux fluorescents de la taille d’un 10 mm d’un diamètre de 10 mm centrés sur un noyau positif au DAPI en cliquant sur chaque événement à partir d’au moins 10 cellules par mouche, à partir d’au moins 10 mouches par âge par type de particule injectée : Plugins à Analyze à Cell Counter Notice ( Figure5A). L’outil de remarque de compteur de cellules attribue une couleur différente à chaque cellule suivie, avec un point coloré qui correspond à chaque événement fluorescent cliqué sur dans cette cellule. Pour répertorier la position de compteur et de pile associée à chaque point, appuyez sur ‘m’ ou sélectionnez Mesure sous l’onglet Analyser, ou pour afficher le nombre d’événements comptés dans chaque cellule dans une table de résultats, appuyez sur ‘alt +y’ (Figure 5B). Transférez le nombre de cellules dans une feuille de calcul à utiliser pour l’analyse statistique. Effectuer une analyse statistique. Analyser les différences dans les événements phagocytiques à l’aide d’ANOVA à effets fixes ou d’ANOVA imbriqué à modèle mixte. Des modèles mixtes peuvent être utilisés pour tester les principaux effets fixes de l’âge et du génotype et l’effet aléatoire des individus imbriqués dans chaque génotype17.REMARQUE : Les enquêteurs doivent faire des tests rigoureux pour tester les hypothèses de toute procédure statistique utilisée pour analyser les données.