Valutare la capacità fagocitica specifica per età degli emociti di Drosophila melanogaster adulto utilizzando un in vivo Phagocitosis

1. Raccogliere e l’età di Drosophila Per generare gli stessi moscerini F1 invecchiati per testare la fagocitosi, aggiungere 5-10 femmine vergini e 5 maschi dei genotipi appropriati a una fiala contenente cibo fresco a mosca. Usiamo un alimento a base di melassa di farina di mais20, ma il metodo dovrebbe funzionare indipendentemente dal tipo di dieta su cui vengono allevate le mosche. Per questo esperimento abbiamo usato Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP vola per etichettare gli emociti geneticamente.NOTA: È possibile utilizzare più mosche, ma alcune linee di D. melanogaster potrebbero non accoppiarsi o riprodursi bene quando sovraffollato, e il sovraffollamento può avere effetti negativi sullo sviluppo larvale21 e sulla fagocitosi. Mantenere le mosche nelle condizioni sperimentali desiderate. Per questo esperimento, mantenere He-GAL4; UAS-GFP vola a 24 gradi centigradi. Consentire alle mosche adulte di accoppiarsi per una settimana, e quindi rimuovere gli adulti. Le mosche F1 saranno quindi raccolte da queste fiale dopo l’eclosione per uso sperimentale. Raccogli le mosche vergini per tutta la settimana, o fino a quando non vengono raccolti il numero desiderato di mosche. Le vergini non sono necessarie; tuttavia, l’accoppiamento può avere un impatto sulla risposta immunitaria. Se le mosche F1 devono essere testate come vergini, separare maschi e femmine entro 8 ore dall’eclosione e mantenersi in fiale separate per prevenire l’accoppiamento. Raccogliere un numero sufficiente di mosche per consentire la valutazione della fagocitosi in almeno 10 mosche per genotipo/trattamento/sesso per età. Se l’invecchiamento delle mosche vola a una settimana, raccogliere almeno 50 mosche in totale, o 20 mosche per condizione di trattamento per ogni particella, sia fluoro-particelle o particelle sensibili al pH, da iniemettere. Ciò garantirà un minimo di 10 mosche per il saggio al momento dell’esperimento. Se l’invecchiamento vola a più di 3 settimane, raccogliere almeno 100-150 mosche totali, o 50-75 mosche per condizione di trattamento per garantire che ci siano abbastanza mosche disponibili per misurare la fagocitosi. Quando l’invecchiamento vola in laboratorio, in genere utilizziamo gabbie di insetti mantenute a 24 gradi centigradi in 12:12 L:D condizioni, e cambiare il cibo a giorni alteranti. Se vengono utilizzate fiale al posto delle gabbie, le mosche in nuove fiale ogni 3-5 giorni, a seconda delle condizioni del cibo nella fiala. Il numero di mosche necessarie dipenderà da quanto in ritardo in età sarà la fagocitosi, e i tassi di sopravvivenza specifici per età di quel genotipo in una particolare condizione ambientale. Se si valutano le mosche giovani e invecchiate, pianificare di conseguenza in modo che le mosche di 1 settimana di età e di età vengano iniettate nello stesso giorno. Ciò ridurrà al minimo le variazioni nella concentrazione di particelle tra gli esperimenti e garantirà che l’effetto dell’età sulla misurazione fagocitica non sia confuso con l’effetto del giorno in cui è stato eseguito il saggio. Casa le mosche raccolte a 24 gradi centigradi fino a quando non hanno 5-7 giorni, o mantenere le mosche all’età desiderata. 2. Preparare particelle etichettate fluorescenti Ricostituire le particelle di E. coli fluoro-particelle o particelle e. coli sensibili al calore a una concentrazione di stock rispettivamente di 20 mg/mL o 1 mg/mL. Altri batteri sono disponibili per l’uso che possono essere più adatti per alcuni esperimenti, ma fare riferimento alle istruzioni del produttore per le concentrazioni di scorte appropriate. Per le particelle fluoro-particelle, aggiungere 990 luna di 1x PBS (pH 7,4) o buffer preferito e 10 L di 2 mM (20%) azide di sodio. Vortice da mescolare.NOTA: l’azide di sodio è un conservante che può essere omesso; tuttavia, le particelle preparate senza azide di sodio non durano a lungo. Le particelle di fluoro devono essere utilizzate entro 24 ore e le particelle sensibili al pH devono essere utilizzate entro 7 giorni. Per le particelle sensibili al pH, aggiungere 1.980 lun di 1x PBS (pH 7,4) o buffer preferito e 20 l uni-l di 2 mM (20%) azide di sodio. Vortice da mescolare. In tubi di microcentrifuga monouso sono stati in tubi a microcentrifuga da 1,5 mL. Conservare le particelle di fluoro a -20 gradi centigradi per un massimo di un anno, e le particelle sensibili al pH a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi, protette dalla luce. Il giorno delle iniezioni, rimuovere l’azie di sodio dalle particelle prima dell’uso. Per fare questo, centrifugare le particelle per 5 min a 15.000 x g a temperatura ambiente. Rimuovere le particelle supernatali e lavate due volte rispendendo in 50 : L di 1x PBS o tampone preferito, e centrifugare per 5 min a 15.000 x g. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere le particelle supernatali e resospendono in 100 gradi l di 1x PBS o buffer preferito. Mantenere la soluzione nel tubo e ridurre al minimo l’esposizione alla luce durante l’esperimento. Una volta rimossa l’acidipite di sodio, utilizzare particelle di fluoro entro 24 h e particelle sensibili al pH utilizzate entro 5-7 giorni.NOTA: Nei nostri esperimenti precedenti, abbiamo scoperto che questa concentrazione di particelle forniva un numero numerabile di eventi fagocitici e che il numero di particelle disponibili per la fagocitosi da emociti non limitava17. Tuttavia, gli utenti di questo protocollo potrebbero voler confrontare i risultati utilizzando altre concentrazioni per garantire che vi sia un numero adeguato di particelle disponibili per la fagocitosi da parte degli emociti nelle condizioni dei loro esperimenti. Se l’azide di sodio è stato omesso, diluire le particelle 1:5 nello stesso buffer con cui sono state preparate le particelle, per le iniezioni. Aggiungete una goccia di colorante verde per il cibo alle particelle. Questo rende più facile garantire che le mosche siano state iniettate. 3. Iniettare le mosche Preparare gli aghi di vetro per le iniezioni. Tirare gli aghi di vetro utilizzando un tiratore pipette. Impostare il riscaldatore estraente pipetta a 55 gradi centigradi e il solenoide a 45. Utilizzare solo gli aghi forniti con l’iniettore, in quanto non è garantito che altri aghi funzionino con la stessa precisione. Riempire una siringa sterile da 1 mL con olio minerale e attaccare l’ago ipodermico (G) da 30 calibro, fornito con il nanoiniere. Riempire l’ago capillare tirato inserendo l’ago da 30 G nell’estremità smussata dell’ago di vetro tirato e riempire con olio minerale. Rimuovere lentamente l’ago da 30 G, assicurandosi che non ci siano bolle d’aria in tutto l’ago, in quanto ciò può causare volumi di iniezione imprecisi. L’iniettore non funziona correttamente senza riempire l’ago. Utilizzando pinze, rompere la punta dell’ago per creare un’apertura per consentire l’espulsione della soluzione. Assemblare il nano-iniettore.NOTA: È possibile utilizzare altri iniettori. Il metodo descritto di seguito si applica al nano-iniettore. Per altri iniettori, consultare il manuale dell’utente per le istruzioni. Impostare l’iniettore sul volume desiderato (tra 46 nL e 69 nL). Rimuovere il collet e posizionare l’anello O di sguarsione, lo spaziopinatore bianco con l’indentazione rivolta verso l’alto per ricevere la parte posteriore dell’ago e l’anello O più grande sullo stantuffo metallico, in questo ordine. Riattaccare il collet senza stringerlo. Inserire lo stantuffo metallico nell’estremità smussata dell’ago di vetro pieno di olio. Spingere delicatamente l’ago verso il basso, inserendolo nell’anello O più grande. Stringere la collet fino a quando non è sicura.NOTA: Se lo stantuffo metallico non si estende oltre il collet, tenere premuto ‘EMPTY’ fino a quando lo stantuffo non è visibile. Questo rende più facile assicurarsi che lo stantuffo sia inserito nell’ago. Tenere premuto “EMPTY” finché l’iniettore non emette un bip. Questo espelle la maggior parte dell’olio minerale dall’ago, lasciando un piccolo volume di olio per agire come una barriera tra i due liquidi, così come rimuove le bolle d’aria. Riempire l’ago con particelle di fluoro o particelle sensibili al pH inserendo la punta dell’ago di vetro nel tubo di microcentrifuga contenente le particelle preparate. Tenere premuto FILL finché l’iniettore non emette un bip. Iniezioni Trasferire le mosche che devono essere iniettate in una fiala vuota. Immobilizzare le mosche mettendo la fiala nel ghiaccio. CO2 può essere utilizzato anche per immobilizzare le mosche. Tuttavia, si noti che, quando si utilizzano particelle sensibili al pH, livelli elevati di CO2 possono acidificare artificialmente qualsiasi buffer utilizzato e possono elevare la fluorescenza di fondo. Iniettare le mosche nella piastra sternopeurale del torace (Figura 1A). L’iniezione ha esito positivo se si vede colorare verde andando in volo (Figura 1B). Se la mosca non diventa verde, assicurati che l’ago non sia ostruito.NOTA: In alternativa, le mosche possono essere iniettate nell’addome, ma mantengono il sito di iniezione coerente in tutti gli esperimenti. Mettere le mosche iniettate in una nuova fiala alimentare, notando il tempo in cui è stata iniettata la prima e l’ultima mosca. Per ridurre al minimo l’errore sperimentale a causa della quantità di tempo necessario per completare le iniezioni, completare le iniezioni in modo tempestivo. Con la pratica, non dovrebbe richiedere più di 10 min per iniettare un set di mosche. Posare la fiala su un fianco fino a quando tutte le mosche si sono riprese, per evitare che le mosche rimangano bloccate nel cibo. Lasciare che le mosche si riprendano per 60-90 min, a seconda delle condizioni sperimentali. Qui, è stato utilizzato un tempo di recupero di 60 min. Si noti che questo intervallo di tempo di recupero era ottimale per il conteggio degli eventi fagocitici nelle condizioni sperimentali nellostudioHorn et al. Tuttavia, in alcune condizioni, questo può essere troppo lungo per rilevare sottili differenze nella fagocitosi tra i gruppi di trattamento. Può essere utile effettuare esperimenti di percorso temporale come è stato fatto in precedenza17 per determinare il tempo di recupero che rivelerà le differenze massime tra controllo e risultati sperimentali. Qualunque sia il tempo di recupero scelto, mantieni questo coerente in tutti i trattamenti sperimentali. Se si iniettano particelle di fluoro e particelle sensibili al pH nello stesso giorno, utilizzare un nuovo ago per ogni soluzione. Non iniettare singole mosche con entrambe le particelle se entrambe fluorescenza rossa, poiché il risultato non distinguerebbe tra i due aspetti della fagocitosi, legamento/inghiottimento delle particelle e inclusione di particelle nel fagosoma. 4. Dissecting della nave dorsale Dopo che le mosche si sono riprese per 60-90 min, trasferite tutte le mosche viventi su una fiala vuota e immobilizzate sul ghiaccio. Trasferire una mosca alla volta su una piastra di dissezione di elastomeri in silicone.NOTA: Preparare le piastre di dissezione almeno 1 settimana prima dell’uso, se si cura a temperatura ambiente. Per fare questo, preparare l’elastomer e versarlo in un piatto Petri da 33 mm x 10 mm, riempiendo il piatto circa a metà strada. Toccare delicatamente il piatto su una superficie piana per ridurre al minimo le bolle d’aria. Lasciate che le piastre si siedano a temperatura ambiente, indisturbate, per almeno una settimana. Sotto un microscopio stereo dissezioso, orientare il lato ventrale di mosca verso l’alto. Utilizzando perni di insetti, pin la mosca sulla piastra inserendo un perno attraverso il torace e un altro perno attraverso l’estremità più posteriore dell’addome, vicino ai genitali (Figura 2A). Può essere utile tagliare i perni a metà prima di appuntare il campione in modo da non ostacolare la dissezione. Ripetere con un massimo di 10 mosche per piastra di dissezione.NOTA: Facoltativo: rimuovere le ali e le gambe prima di bloccare volare alla piastra. Questo aiuterà a prevenire la formazione di una bolla intorno al volo quando vengono aggiunti i media. Una volta che tutte le mosche sono state appuntate al piatto, aggiungete un numero sufficiente di supporti di dissezione per coprire le mosche (1 mL) utilizzando un tubo di trasferimento. Utilizzando pinze o forbici cuticola, rimuovere la testa. Utilizzando le forbici cuticola, fare due incisioni orizzontali: uno direttamente sopra il perno posteriore nell’addome, e un altro all’estremità più anteriore dell’addome, dove il torace e l’addome si incontrano (Figura 2B, C). Nella Figura 2, la testa è stata lasciata intatta per chiarire l’orientamento. Fare un’incisione verticale, collegando le due incisioni orizzontali (i tre tagli assomigliano alla lettera I). Questo aprirà la cavità addominale (Figura 2D). Utilizzando pinze, rimuovere gli organi interni e il tessuto, evitando il vaso dorsale. Se indisturbato, il recipiente dorsale trasparente può spesso essere visto pulsare vicino all’estremità anteriore dell’addome. Perni aggiuntivi possono essere utilizzati per fissare le estremità aperte della cuticola (Figura 2E, F). Utilizzando le forbici cuticola, rimuovere il torace. In alternativa, il torace può essere rimosso prima di montare le cuticle sezionate e la nave dorsale su un vetrino al microscopio. Ripetere con le mosche rimanenti.  sezionare vola in modo tempestivo, per ridurre al minimo le possibili variazioni del tasso fagocitico. Una volta che tutte le mosche sono state sezionate, lasciare le cutiche con il vaso dorsale attaccato appuntato al piatto. Tutti i passaggi 5 saranno effettuati nella piastra di dissezione. Ciò impedirà di danneggiare o accidentalmente scartare le cutiche tra i passi. 5. Fissaggio e colorazione Fissare cuticoli sezionati con vaso dorsale attaccato in 4% paraformaldeide (PFA). Utilizzando un nuovo tubo di trasferimento usa e getta per ogni passo, scartare il supporto di dissezione e sostituirlo con 1 mL del 4% PFA. Durante la fissazione e la colorazione, mantenere le dissezioni protette dalla luce il più possibile. Incubare a temperatura ambiente per 15 min con dondolo a 20 rpm. Non permettere che le dissezioni si siedano fissativo per più di 20 min, in quanto ciò potrebbe iniziare a danneggiare il tessuto. Lavaggio cuticoles 2x in 1x PBS – 0.1% Tween (PBST). Rimuovere il fissativo e sostituirlo con 1 mL di 1x PBST. Lavare a temperatura ambiente per 15 min con dondolo. Ripetere 1x.NOTA: Il tessuto fisso può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi, per un massimo di 3 giorni, protetto dalla luce, dopo il primo lavaggio sostituendo il lavaggio con PBST fresco. Non conservare il tessuto fisso se verranno utilizzati anticorpi. Gli anticorpi devono essere utilizzati con tessuti freschi per ottenere i migliori risultati. Facoltativo: colorazione anticorpale. Gli anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare chiaramente la nave dorsale in modo chiaro (Figura 3)o per rilevare marcatori specifici per emociti. Questo può garantire che solo le cellule lungo il recipiente dorsale siano conteggiate o per marcare la membrana degli emociti. Rimuovere il secondo lavaggio, aggiungere l’anticorpo primario alla diluizione appropriata. Incubare pertutta la notte a 4 gradi centigradi, con dondolo. Rimuovere l’anticorpo primario e lavare due volte con PBST per 15 min con dondolo. Aggiungere l’anticorpo secondario fluorescente. Si consiglia un anticorpo verde-fluorescente in modo che non oscuri le particelle fluorescenti. Incubare a temperatura ambiente per 2 h, con dondolo. Rimuovere l’anticorpo secondario, lavare due volte per 15 min ciascuno con PBST. Macchia con DAPI. Rimuovere il lavaggio finale e sostituire con 1 mL di DAPI diluito in PBST (1:1000). Macchie per 20 min con dondolo a temperatura ambiente. Rimuovere DAPI e lavare 2x (ripetere il passaggio 5.2). Sostituire il lavaggio finale con 1x PBST fresco.NOTA: Le mosche possono essere conservate a 4 gradi centigradi, per un massimo di 3 giorni, protette dalla luce, dopo il primo lavaggio sostituendo il lavaggio con PBST fresco. 6. Montaggio di cutici su vetrini al microscopio e immagini Preparare cutici sezionati. Sotto lo stereoscopio dissezioso, tagliare la cuticola in eccesso che potrebbe interferire con l’imaging. Utilizzando pinze, trasferire le cutici con recipiente dorsale attaccato in un tubo di microcentrifuga di 1,5 mL contenente il 70% di glicerolo. L’inserimento delle cuticoli nel glicerolo aiuterà a rimuovere il PBST e consentirà un’immagine più chiara durante l’imaging. Montare le cutiche sul vetrino del microscopio. Aggiungere qualche goccia di glicerolo 70% a un vetrino al microscopio. Utilizzando pinze, rimuovere le cutici dal tubo glicerolo e mettere in glicerolo sul vetrino. Sotto il microscopio stereo dissezioso, utilizzare pinze per orientare le cuticoli lato ventrale verso l’alto, assicurando che il vaso dorsale sia visibile. Il pigmento più scuro della cuticola sarà rivolto verso il basso. Aggiungere un’ulteriore goccia di glicerolo, se necessario. Questo aiuta a prevenire le bolle d’aria e consente un’immagine più chiara. Posizionare delicatamente una coverslip sopra le cutici e i bordi di sigillazione con lo smalto delle unghie. Lasciare asciugare per 10-15 min prima di procedere. Immagina le mosche immediatamente o conservatevi in una scatola a prova di luce a 4 gradi centigradi. Immagine del vaso dorsale. Utilizzando un microscopio fluorescente, utilizzare il sistema di interferenza strutturale per generare sezioni ottiche del vaso dorsale. In alternativa, è possibile utilizzare un microscopio confocale che può fornire ulteriore precisione. Ottenere immagini di impilamento z della nave dorsale utilizzando un software di imaging obiettivo e preferito 20x. Aggiungere una barra di scala di 10 mm e etichettare e salvare correttamente le immagini come file tiff (Figura 4) o nel formato desiderato.NOTA: Il numero di immagini di stack z ottenute può variare tra le dissezioni e dipende da quanto bene il vaso dorsale è stato sezionato, e dalla dimensione del gradino desiderato tra le immagini. Qui, la dimensione del passo è stata impostata su 0,49 mm. Questo numero può variare da 3 a 40 immagini per pila nella nostra esperienza. 7. Analizzare le immagini Quantifica gli eventi fluorescenti utilizzando ImageJ. Aprire le immagini e impilarle: Immagine à Stack s à immagini in pila. Contare solo i segnali fluorescenti di dimensioni 1 mm all’interno di un diametro di 10 mm centrato su un nucleo POSITIVO DAPI facendo clic su ogni evento da almeno 10 celle per mosca, da almeno 10 mosche per età per tipo di particella iniettato: Plugins à Analyze à Cell Counter Notice ( Figura5A). Lo strumento di notifica del contatore delle celle assegna un colore diverso a ogni cella tracciata, con un punto colorato che corrisponde a ogni evento fluorescente su cui si è fatto clic all’interno di tale cella. Per elencare il contatore e la posizione dello stack associati a ciascun punto, premere ‘m’ o selezionare Misura nella scheda Analizza oppure per visualizzare il numero di eventi conteggiati in ogni cella in una tabella dei risultati, premere ‘alt ‘y'(Figura 5B). Trasferire i conteggi delle celle in un foglio di calcolo da utilizzare per l’analisi statistica. Eseguire analisi statistiche. Analizzare le differenze negli eventi fagocitici utilizzando ANOVA a effetti fissi o ANOVA annidati a modello misto. I modelli misti possono essere utilizzati per testare i principali effetti fissi dell’età e del genotipo e l’effetto casuale di individui nidificati all’interno di ogni genotipo17.NOTA: Gli investigatori devono essere rigorosi nel testare i presupposti di qualsiasi procedura statistica utilizzata per analizzare i dati.