インビボファゴサイトーシスアッセイを用いた成人ショウジョウバエのメラノガステル血球の年齢特異的食細胞能力の評価

1. ショウジョウバエを収集し、年齢を重ね 同じ熟成F1ハエを食細胞化をテストするために生成するには、5〜10人の処女メスと5人の雄を新鮮なハエ食品を含むバイアルに加えます。コーンミール糖蜜ベースの食べ物20を使用していますが、ハエが飼育されている食事の種類に関係なく、この方法は機能するはずです。この実験では、ヘメセ(He)-GAL4を使用しました。UAS-GFPは、遺伝的に血球にラベルを付けるために飛びます。注:より多くのハエを使用することができますが、D.メラノガスターのいくつかのラインは、過密状態のときにうまく交尾または繁殖しない可能性があり、過密状態は幼虫の発達21と食細胞症に悪影響を及ぼす可能性があります。 目的の実験条件下でハエを維持します。この実験では、He-GAL4 を維持します。UAS-GFPは24°Cで飛行します。大人のハエが1週間交尾することを許可し、その後、大人を削除します。F1ハエは、実験的使用のためのエローション後にこれらのバイアルから収集されます。 週を通して、またはハエの所望の数が収集されるまで、処女ハエを収集します。処女は必要ありません。しかし、交配は免疫応答に影響を与える可能性があります。F1ハエが処女としてテストされる場合は、エローションの8時間以内に男性と女性を分離し、交配を防ぐために別々のバイアルに維持します。年齢ごとに遺伝子型/治療/性別あたり少なくとも10ハエの貪食の評価を可能にするのに十分なハエを集める。 ハエを1週間に加齢させた場合、注入される粒子(フルオロ粒子またはpH感受性粒子のいずれか)について、治療条件ごとに少なくとも50ハエ、または20ハエを採取する。これにより、実験時に最低10個のハエがアッセイされます。 老化が3週間以上に飛ぶ場合は、少なくとも100〜150ハエを合計、または治療条件ごとに50〜75ハエを収集して、食道障害を測定するのに十分なハエがあることを確認します。実験室でハエを老化させると、通常、12:12 L:Dで24°Cに維持された昆虫ケージを使用します。条件、および一日おきに食べ物を変更します。バイアルがケージの代わりに使用されている場合、チップはバイアルの食品の状態に応じて、3〜5日ごとに新しいバイアルに飛びます。必要なハエの数は、年齢食細胞症の遅れ、および特定の環境条件におけるその遺伝子型の年齢特異的生存率に依存する。 若年ハエと高齢のハエを評価する場合は、同じ日に1週間の生後および高齢のハエが注入されるように、それに応じて計画してください。これにより、実験間の粒子濃度の変動を最小限に抑え、食作用測定に対する年齢の影響がアッセイが行われた日の効果と混乱しないようにします。 収集したハエを生後5~7日になるまで24°Cで収容するか、またはハエを所望の年齢に維持します。 2. 蛍光標識粒子の調製 熱死した大腸菌フルオロ粒子またはpH感受性大腸菌粒子をそれぞれ20mg/mLまたは1mg/mLのストック濃度に再構成する。他の細菌は、特定の実験に適している可能性がありますが、適切な在庫濃度についてはメーカーの指示を参照してください。 フルオロ粒子の場合、1x PBS(pH 7.4)または好ましいバッファーの990 μL、2 mM(20%)の10 μLを加えるアジドナトリウム。混ぜる渦。注:アジドナトリウムは省略することができる防腐剤です。しかし、アジドナトリウムなしで調製された粒子は、長持ちしません。フルオロ粒子は24時間以内に使用する必要があり、pH感受性粒子は7日以内に使用する必要があります。 pHに敏感な粒子の場合、1x PBS(pH 7.4)または好ましいバッファの1,980 μLおよび2mM(20%)の20 μLを加えるアジドナトリウム。混ぜる渦。 1.5 mLマイクロ遠心チューブで、複数の単回使用20 μLアリコートを作ります。フルオロ粒子を-20°Cで最長1年間保存し、pH感受性粒子を4°Cで最大6ヶ月間保存し、光から保護します。 注射の日に、使用前に粒子からアジドナトリウムを取り除きます。これを行うには、室温で15,000 x gで5分間粒子を遠心分離する。 上清を取り除き、1xPBSまたは好ましいバッファーの50μLで再懸濁して粒子を2回洗浄し、遠心分離機を15,000xgで5分間洗浄する。 g 2回目の洗浄後、上清を取り除き、1xPBSまたは好ましい緩衝液の100μLで粒子を再懸濁します。チューブ内の溶液を保持し、実験中の光への暴露を最小限に抑えます。アジ化ナトリウムを除去したら、24時間以内にフルオロ粒子を使用し、5〜7日以内に使用したpH感受性粒子を使用する。注:以前の実験では、この粒子の濃度は、貪食事象の数が数え切れないほどの数を提供し、血球による食細胞に利用可能な粒子の数が17を制限していないことを発見しました。しかし、このプロトコルのユーザーは、実験の条件で血球によって食細胞に利用可能な粒子の十分な数があることを確認するために、他の濃度を使用して結果を比較したい場合があります。 アジ化ナトリウムを省略した場合、粒子を調製した同じバッファー内の粒子1:5を、注射用に希釈する。 粒子に緑色の食品着色の滴(約10μL)を加えます。これにより、ハエが注入されたことを確認することが容易になります。 3. ハエを注入する 注射のためのガラス針を準備します。 ピペットプーラーを使用してガラスの針を引きます。ピペットプーラーヒーターを55°C、ソレノイドを45に設定します。他の針が同じ精度で動作することは保証されていないので、注射器に付属の針のみを使用してください。 1 mLの滅菌シリンジに鉱物油を充填し、30ゲージの皮下(G)針を取り付け、ナノインジェクターを設ける。 引っ張られたガラスの針の鈍い端に30 Gの針を挿入することによって引っ張られた毛細血管の針を埋め、ミネラルオイルで満たす。30G針をゆっくりと取り外し、不正確な注入量を引き起こす可能性があるので、針全体に気泡がないことを確認します。注射器は針をバックフィリングしないと正常に動作しません。 鉗子を使用して、針の先端を切断して開口部を作り、溶液の放出を可能にする。 ナノインジェクターを組み立てます。注:他のインジェクターも使用できます。以下に説明する方法は、ナノインジェクタに適用される。その他のインジェクタについては、ユーザーマニュアルで説明書を参照してください。 インジェクタを目的のボリューム(46 nL~69 nL)に設定します。 コレットを取り外し、シールOリング、針のバックエンドを受け取るために上向きのインデントを持つ白いスペーサー、そしてより大きなOリングを金属プランジャーの上に置きます。コレットを締め付けずに取り付け直します。 金属プランジャーを油で満たされたガラス針の鈍い端に挿入します。針を軽く押し下げ、大きなOリングに挿入します。コレットをしっかりと締めます。注:金属プランジャーがコレットを越えて伸びない場合は、プランジャが表示されるまで「EMPTY」を押したままにします。これにより、プランジャーが針に挿入されることを確認しやすくなります。 インジェクタのビープ音が鳴るまで「EMPTY」を押したままにします。これは、針からミネラルオイルのほとんどを排出し、2つの液体間の障壁として機能する少量の油を残すだけでなく、気泡を除去する。 調製した粒子を含むマイクロ遠心分離管にガラス針の先端を挿入することにより、フルオロ粒子またはpH感受性粒子のいずれかで針を充填する。 インジェクタのビープ音が鳴るまで「FILL」を押し続ける。 注射 空のバイアルに注入されるハエを移します。バイアルを氷の中に入れることでハエを固定化します。CO2はハエを固定化するためにも使用できる。しかし、pH感受性粒子を使用する場合、CO2レベルの上昇は、使用されている任意のバッファを人工的に酸性化することができ、バックグラウンド蛍光を上昇させることができることに注意してください。 胸郭の子宮板にハエを注入する(図1A)。緑色の染料がフライに入ると、注射は成功する(図1B)。フライが緑色に変らない場合は、針が詰まっていることを確認してください。注:または、ハエは腹部に注入することができますが、すべての実験で一貫した注射部位を維持することができます。 最初と最後のハエが注入された時間に、注入されたハエを新しい食品バイアルに入れる。注射の完了にかかる時間による実験誤差を最小限に抑えるために、適時に注射を完了する。練習では、ハエの1セットを注入するのに10分以上かかるはずです。ハエが食べ物に詰まるのを防ぐために、すべてのハエが回復するまで、バイアルを横に置きます。 実験条件に応じて、ハエが60〜90分間回復できるようにします。ここでは、60分の回復時間を使用した。この回復時間範囲は、Hornらの研究17の実験条件における貪食事象をカウントするのに最適であったことに注意してください。しかし、いくつかの条件下では、これは治療群間の食細胞化の微妙な違いを検出するには長すぎるかもしれません。制御と実験結果の間に最大の違いを明らかにする回復時間を決定するために、以前の17で行われたようにタイムコース実験を行うことが有用である可能性があります。どのような回復時間が選択されても、すべての実験的治療にわたってこの一貫性を保ちます。 同じ日にフッ素粒子とpH感受性粒子を注入する場合は、溶液ごとに新しい針を使用してください。結果はファゴソームに含まれる粒子結合/巻き込みとの間で区別されない結果、結果が赤を蛍光を発する場合は、個々のハエを両方の粒子を注入しないでください。 4. 裏下船の解剖 ハエが60〜90分間回復した後、すべての生きているハエを空のバイアルに移し、氷の上に固定します。 一度に1つのフライをシリコーンエラストマー解剖プレートに移します。注:室温で硬化する場合は、使用の少なくとも1週間前に解剖プレートを準備してください。これを行うには、エラストマーを準備し、約半分の皿を充填し、33ミリメートルx 10ミリメートルペトリ皿にそれを注ぎます。空気泡を最小限に抑えるために、平らな表面の皿を軽くタップします。プレートは、少なくとも1週間は、邪魔されずに室温で座らせます。 解剖ステレオ顕微鏡の下で、フライ腹側を上方向に向けます。 昆虫ピンを使用して、胸郭を通して1つのピンを挿入し、もう1つのピンを腹部の最も後端(生殖器の近く)に挿入してフライをプレートに固定します(図2A)。解剖を妨げないように、検体を固定する前にピンを半分に切断すると便利です。解剖プレートあたり最大10ハエで繰り返します。注: オプション: プレートにフライを固定する前に、翼と脚を取り外します。これは、メディアが追加されたときにハエの周りに泡が形成されるのを防ぐのに役立ちます。 すべてのハエがプレートに固定されたら、トランスファーピペットを使用してハエ(約1 mL)をカバーするのに十分な解剖媒体を追加します。 鉗子またはキューティクルはさみを使用して、頭を取り外します。 キューティクルはさみを使用して、2つの水平切開を行います:1つは腹部の後部ピンのすぐ上にあり、もう1つは腹部の最も前端にあり、胸郭と腹部が出会う(図2B、C)。図2では、頭部は、向きを明確にするためにそのまま残された。 垂直切開を行い、2つの水平切開を接続します(3つの切り傷は文字Iに似ています)。これにより腹腔が開きます (図 2D)。 鉗子を使用して、内臓および組織を取り除き、後部血管を避ける。邪魔されない場合、透明な後ろ容器は腹部の前端付近で脈動しているのをよく見ることができる。追加のピンを使用して、キューティクルの新しく切断された端部をピンで留めることができます(図2E、F)。 キューティクルはさみを使用して、胸郭を取り除く。あるいは、胸郭は、顕微鏡スライド上に解剖されたキューティクルおよび後回り容器を取り付ける前に取り外すことができる。 残りのハエで繰り返します。 食性速度の可能な変動を最小限に抑えるために、タイムリーにハエを解剖する。すべてのハエが解剖されたら、付属の後ろ容器をプレートに固定したキューティスルのままにしておきます。ステップ5の全ては、解剖板で行われる。これにより、ステップ間のキューティークルが損傷したり、誤って廃棄されたりするのを防ぐことができます。 5. 固定と染色 4%パラホルムアルデヒド(PFA)に付着した後嚢を取り付けたクチクルを固定します。 各ステップに新しい使い捨て転送パイプを使用して、解剖媒体を廃棄し、4%PFAの1 mLに交換してください。固定と染色を通して、切除をできるだけ光から保護してください。 20rpmで揺れで15分間室温でインキュベートします。解剖は、組織に損傷を与え始める可能性があり、20分以上固定剤に座ることを許可しないでください。 1x PBS + 0.1% トゥイーン (PBST) でキューティクル 2x を洗浄します。 固定液を取り除き、1x PBSTの1 mLに交換してください。 ロッキングで室温で15分間洗浄します。 1x を繰り返します。注:解剖された固定組織は、新鮮なPBSTで洗浄を交換することにより、最初の洗浄後、光から保護され、最大3日間、4°Cで保存することができます。抗体を使用する場合は、固定組織を保存しないでください。抗体は、最良の結果を得るには、新鮮な組織と一緒に使用する必要があります。 任意:抗体染色。抗体は、体細胞の軟体血管を明確に可視化するために使用され(図3)、またはヘモサイト特異的マーカーを検出することができる。これは、後部血管に沿った細胞のみがカウントされるか、または血球の膜をマークすることを保証することができる。 第二の洗浄を除去し、適切な希釈で一次抗体を加える。4°Cで一晩インキュベートし、ロッキングします。 一次抗体を除去し、PBSTで2回、ロッキングで15分間洗浄します。 蛍光二次抗体を追加します。蛍光性粒子を覆い隠さないため、緑色蛍光抗体をお勧めします。室温で2時間、ロッキングでインキュベートします。 二次抗体を取り除き、PBSTでそれぞれ15分間2回洗浄する。 DAPI で汚す。 最終的な洗浄を取り除き、PBSTで希釈したDAPIの1mL(1:1000)に交換してください。 室温で揺れる20分間の汚れ。 DAPIを取り外し、2倍洗います(ステップ5.2を繰り返します)。 最終洗浄を新鮮な1x PBSTに交換してください。注:ハエは、新鮮なPBSTで洗浄を交換することにより、最初の洗浄後、光から保護され、最大3日間、4°Cで保存することができます。 6. 顕微鏡スライドへのキューティークルの取り付けとイメージング 解剖されたキューティークルを準備します。 解剖の実体顕微鏡の下で、画像化を妨げる可能性のある余分なキューティクルを切り落とす。 鉗子を使用して、70%グリセロールを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに付着した後ろ容器を持つキューティークルを移す。グリセロールにキューティクルを入れることでPBSTを除去し、イメージング中に鮮明な画像を可能にします。 顕微鏡のスライドにキューティークルを取り付けます。 顕微鏡スライドに70%のグリセロールを数滴加えます。 鉗子を使用して、グリセロールチューブからキューチクルを取り除き、スライド上のグリセロールに入れる。 解剖ステレオ顕微鏡の下で、キューティクルの腹側を上に向けるために鉗子を使用し、後部血管が見えるようにする。キューティクルの暗い顔料は下向きになります。 必要に応じて、グリセロールの追加のドロップを追加します。これは気泡を防ぐのに役立ち、より鮮明な画像を可能にします。 キューティークルの上にカバースリップをそっと置き、指の爪を磨いて縁を密封します。先に進む前に10〜15分間乾燥させます。すぐにハエをイメージするか、4°Cの防光箱に保管してください。 後ろの容器をイメージします。 蛍光顕微鏡を使用して、構造的干渉システムを使用して、後部血管の光学断面を生成します。共焦点顕微鏡は、追加の精度を提供することができる代替的に使用することができます。20倍の目的および好ましいイメージングソフトウェアを使用して、後ろ船のZスタック画像を取得します。10 mm スケール バーを追加し、イメージに適切なラベルを付けて TIFF ファイル (図 4)または目的の形式で保存します。注:得られるZスタック画像の数は解剖によって異なり、裏容器が解剖された程度、および画像間の望ましいステップサイズによって異なります。ここでは、ステップサイズを0.49mmに設定しました。その数は、私たちの経験では、スタックあたり3〜40の画像の範囲です。 7. 画像の分析 ImageJを使用して蛍光イベントを定量化します。 画像を開いて積み重ねる:イメージ・ア・スタック・ア・イメージ・をスタックに入れます。 DAPI陽性核を中心とする直径10mm以内の~1mmサイズの蛍光信号のみを、注入された粒子タイプあたり少なくとも10ハエから、1飛行あたり少なくとも10個のハエからクリックします:プラグインa Analyzeアセルカウンター通知(図5A)セルカウンター通知ツールは、追跡されるすべてのセルに異なる色を割り当て、そのセル内でクリックされたすべての蛍光イベントに対応する色付きのドットを使用します。 各ポイントに関連付けられたカウンタとスタックの位置を一覧表示するには、[m] を押すか、[分析] タブの [メジャー]を選択するか、または各セルでカウントされたイベント数を結果テーブルに表示するには、’alt +y’ (図 5B)を押します。 統計分析に使用するセル数をスプレッドシートに転送します。 統計分析を実行します。 固定効果 ANOVA または混合モデル化されたネストされた分散分析を使用して、貪食イベントの違いを分析します。混合モデルは、年齢と遺伝子型の主な固定効果と、各遺伝子型17内にネストされた個体のランダム効果をテストするために使用することができる。注: 調査員は、データの分析に使用される統計的手順の仮定をテストする際に厳格にする必要があります。