Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

1. Toplamak ve yaş Drosophila Fagositoz test etmek için aynı yaşlı F1 sinekler oluşturmak için, taze sinek gıda içeren bir şişe için uygun genotipler 5-10 bakire kadın ve 5 erkek ekleyin. Biz bir mısır unu pekmezi agar bazlı gıda20kullanın, ama yöntem sinekler yetiştirilen diyet türüne bakılmaksızın çalışması gerekir. Bu deney için Biz Hemese kullanılır (O)-GAL4; UAS-GFP hemositleri genetik olarak etiketlemek için uçar.NOT: Daha fazla sinek kullanılabilir, ancak D. melanogaster bazı satırları çiftleşemez veya aşırı kalabalık larva gelişimi21 ve fagositoz üzerinde olumsuz etkileri olabilir. İstenilen deneysel koşullar altında sinekler korumak. Bu deney için He-GAL4’ün bakımını koruyun; UAS-GFP 24 °C’de uçar. Yetişkin sineklerin bir hafta çiftleşmesine izin verin ve yetişkinleri çıkarın. F1 sinekleri daha sonra deneysel kullanım için klozyon sonra bu şişelerden toplanır. Hafta boyunca veya sinek istenilen sayıda toplanana kadar bakire sinek toplamak. Bakireler gerekli değildir; ancak, miating bağışıklık yanıtını etkileyebilir. F1 sinekleri bakire olarak test edilecekse, klozyon dan sonraki 8 saat içinde erkekleri ve dişileri ayırın ve çiftlemesini önlemek için ayrı şişelerde muhafaza edin. Her yaş başına en az 10 sinekte fagositozun değerlendirilmesine izin verecek kadar sinek toplayın. Bir hafta sinek yaşlanma varsa, enjekte edilecek her parçacık, ya floro-parçacıklar veya pH duyarlı parçacıklar için tedavi durumu başına en az 50 sinek toplam veya 20 sinek toplamak. Bu, deney sırasında titretmek için en az 10 sinek sağlayacaktır. Yaşlanma 3 haftadan fazla sinekler, toplam en az 100-150 sinek toplamak, ya da 50-75 fagosityolis ölçmek için yeterli sinek olduğundan emin olmak için tedavi durumu başına sinekler. Laboratuvarda yaşlanma sinekleri, genellikle 12:12 L:D 24 °C’de muhafaza böcek kafesleri kullanın koşulları ve her gün gıda değiştirin. Kafesler yerine şişeler kullanılıyorsa, uç şişedeki yiyeceğin durumuna bağlı olarak her 3-5 günde bir yeni şişelere dönüşür. İhtiyaç duyulan sinek sayısı, yaş fagositozunun ne kadar geç analiz edileceğine ve belirli bir çevresel durumda genotipin yaşa özgü sağkalım oranlarına bağlıdır. Eğer genç ve yaşlı sinekler değerlendirilecekse, 1 haftalık ve yaşlı sineklerin aynı gün enjekte edilmesi için buna göre planlayın. Bu, deneyler arasındaki parçacık konsantrasyonu değişimlerini en aza indirecek ve yaşın fagositik ölçüm üzerindeki etkisinin, talın yapıldığı günün etkisiyle şaşkın olmamasını sağlayacaktır. Toplanan sinekleri 5-7 günlük olana kadar 24 °C’de barındırın veya sinekleri istenilen yaşa kadar koruyun. 2. Floresan etiketli parçacıklar hazırlayın Isıda öldürülen E. coli floro-partiküllerini veya pH duyarlı E. coli partiküllerini sırasıyla 20 mg/mL veya 1 mg/mL stok konsantrasyonuna yeniden oluşturun. Diğer bakteriler, bazı deneyler için daha uygun olabilecek, ancak uygun stok konsantrasyonları için üreticinin talimatlarına bakın kullanım için kullanılabilir. Floro partiküller için 990 μL 1x PBS (pH 7.4) veya tercih edilen tampon ve 10 μL 2 mM () ekleyin sodyum azit. Girdap karıştırmak için.NOT: Sodyum azit atlanabilecek bir koruyucudur; ancak sodyum azitolmadan hazırlanan partiküller uzun sürmez. Floro-partiküller 24 saat içinde, pH’a duyarlı parçacıklar ise 7 gün içinde kullanılmalıdır. PH’a duyarlı parçacıklar için 1.980 μL 1x PBS (pH 7.4) veya tercih edilen tampon ve 20 μL 2 mM () ekleyin sodyum azit. Girdap karıştırmak için. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde birden fazla tek kullanımlık 20 μL aliquot yapın. Floro-partikülleri bir yıla kadar -20 °C’de, pH’ya duyarlı parçacıkları ise 4 °C’de 6 aya kadar ışıktan koruyun. Enjeksiyon gününde, kullanmadan önce parçacıklardan sodyum aziti çıkarın. Bunu yapmak için, oda sıcaklığında 15.000 x g 5 dakika için parçacıkları santrifüj. 1x PBS veya tercih edilen tampon 50 μL resuspend tarafından supernatant ve yıkama parçacıkları iki kez çıkarın ve 15.000 x g5 dakika için santrifüj . İkinci yıkamadan sonra, 1x PBS veya tercih edilen tampon 100 μL’lik süpernatant ve resuspend partiküllerini çıkarın. Çözümü tüpte tutun ve deney boyunca ışığa maruz kalmamayı en aza indirin. Sodyum azid çıkarıldıktan sonra, 24 saat içinde floro-parçacıklar kullanın ve 5-7 gün içinde kullanılan pH duyarlı parçacıklar kullanın.NOT: Daha önceki deneylerimizde, bu parçacık konsantrasyonunun fagositik olayların sayılabilir sayılarını sağladığını ve hemositler tarafından fagositoz için mevcut olan parçacıkların sayısının17’yisınırlamadığını gördük. Ancak, bu protokolün kullanıcıları deney koşullarında hemositler tarafından fagositoz için yeterli sayıda parçacık olduğundan emin olmak için sonuçları diğer konsantrasyonları kullanarak karşılaştırmak isteyebilirler. Sodyum azit atlanırsa, parçacıklar enjeksiyonlar için hazırlanan tampon daki 1:5 partikülleri seyreltin. Parçacıklara bir damla (~10 μL) yeşil gıda boyası ekleyin. Bu, sineklerin enjekte edilmesini kolaylaştırır. 3. Sinekleri enjekte edin Enjeksiyonlar için cam iğneler hazırlayın. Pipet çekmecesi kullanarak cam iğneleri çekin. Pipet çekmece ısıtıcısını 55 °C’ye, solenoidi ise 45’e ayarlayın. Diğer iğnelerin aynı hassasiyetle çalışacağı garanti olmadığı için sadece enjektörle birlikte verilen iğneleri kullanın. 1 mL’lik steril şırıngayı mineral yağla doldurun ve nano-enjektörle birlikte verilen 30 göstergeli hipodermik (G) iğneyi takın. 30 G iğneyi çekilen cam iğnenin künt ucuna yerleştirerek çekilen kılcal iğneyi geri doldurun ve mineral yağla doldurun. 30 G iğneyi yavaşça çıkarın, bu da yanlış enjeksiyon hacimlerine neden olabileceğinden, iğne boyunca hava kabarcıkları olmamasını sağlar. Enjektör iğneyi geri doldurmadan düzgün çalışmaz. Forseps kullanarak, çözeltinin atılmasına izin vermek için bir açıklık oluşturmak için iğnenin ucunu kırın. Nano enjektörü birleştirin.NOT: Diğer enjektörler kullanılabilir. Aşağıda açıklanan yöntem nano-enjektör için geçerlidir. Diğer enjekte edenler için talimatlar için kullanım kılavuzuna başvurun. Enjektörü istenilen hacimde ayarlayın (46 nL ile 69 nL arasında). Koltu çıkarın ve sızdırmazlık O-halkası yerleştirin, girintisi kadar iğnenin arka ucunu almak için bakan beyaz spacer, ve metal piston üzerine büyük O-halka, bu sırada. Sıkmadan kolleti yeniden takın. Metal pistonu yağ dolu cam iğnenin künt ucuna yerleştirin. İğneyi yavaşça aşağı doğru itin ve daha büyük O-halkasına takın. Güvenli olana kadar kollet sıkın.NOT: Metal piston koltu ötesine uzanmazsa, piston görünür olana kadar ‘BOŞ’ tuşuna basın ve basılı tutun. Bu, pistonun iğneye yerleştirildiğinden emin olmayı kolaylaştırır. Enjektör arılar kadar ‘BOŞ’ tuşuna basın ve tutun. Bu iğne den mineral yağ çoğu çıkar, yağ küçük bir hacim bırakarak iki sıvı arasında bir bariyer olarak hareket etmek, hem de hava kabarcıkları kaldırır. Hazırlanan parçacıkları içeren mikrosantrifüj tüpüiçine cam iğneucu ekleyerek ya floro-parçacıklar veya pH duyarlı parçacıklar ile iğne doldurun. Enjektör arılar kadar ‘FILL’ tuşuna basın ve tutun. Enjeksiyon Boş bir şişeye enjekte edilecek sinekleri aktarın. Şişeyi buza yerleştirerek sinekleri hareketsiz hale getirin. CO2 de sinekleri hareketsiz leştirmek için kullanılabilir. Ancak, pH’a duyarlı parçacıklar kullanılırken, yüksek CO2 düzeylerinin kullanılan tamponları yapay olarak asitlendirebileceğini ve arka plan floresanını yükseltebileceğini unutmayın. Sinekleri toraksın sternopleural plakasını enjekte edin (Şekil 1A). Yeşil boya sinek içine gidiyor görülürse enjeksiyon başarılı olur (Şekil 1B). Sinek yeşile dönmezse, iğnenin tıkanmaydığından emin olun.NOT: Alternatif olarak, sinekler karın enjekte edilebilir, ancak enjeksiyon alanı tüm deneyler boyunca tutarlı tutun. İlk ve son sinek enjekte edildiği zamana dikkat çekerek, enjekte edilen sinekleri yeni bir besin şişesine yerleştirin. Enjeksiyonların tamamlanması için gereken süre nedeniyle deneysel hatayı en aza indirmek için enjeksiyonları zamanında tamamlayın. Uygulama ile, sinek bir dizi enjekte etmek için en fazla 10 dakika sürer. Tüm sinekler iyileşene kadar şişeyi yan tarafına yatırın, sineklerin yiyeceklere yapışmasını önlemek için. Sinekler 60-90 dakika, deneysel koşullara bağlı olarak kurtarmak için izin verin. Burada 60 dk’lık bir iyileşme süresi kullanılmıştır. Bu iyileşme süresi aralığı Horn ve ark. çalışmada deneysel koşullarda fagositik olayları saymak için en uygun olduğunu unutmayın17. Ancak, bazı koşullar altında, bu tedavi grupları arasında fagositoz ince farklılıklar tespit etmek için çok uzun olabilir. Kontrol ve deneysel sonuçlar arasındaki maksimum farklılıkları ortaya çıkaracak iyileşme süresini belirlemek için daha önce17’de yapıldığı gibi zaman kursu deneylerinin yapılması yararlı olabilir. Ne olursa olsun iyileşme süresi seçilirse seçilsin, tüm deneysel tedaviler de bunu tutarlı tutun. Aynı gün floro-parçacıklar ve pH’ya duyarlı parçacıklar enjekte ediyorsanız, her çözelti için yeni bir iğne kullanın. Her ikisi de floresan kırmızı ise her iki parçacık ile bireysel sinekenjekte etmeyin, sonuç fagositoz iki yönü arasında ayrım olmaz, parçacık bağlama / yutma ve parçacık dahil fagozom. 4. Dorsal damarın kesilmesi Sinekler 60-90 dakika boyunca iyileştikten sonra, tüm canlı sinekleri boş bir şişeye aktarın ve buz üzerinde hareketsiz kalın. Bir seferde bir fly’ı silikon elastomer diseksiyonu plakasına aktarın.NOT: Oda sıcaklığında kür leme durumunda, kullanımdan en az 1 hafta önce diseksiyon plakaları hazırlayın. Bunu yapmak için, elastomer hazırlamak ve yaklaşık yarım çanak doldurarak, 33 mm x 10 mm Petri kabına dökün. Hava kabarcıklarını en aza indirmek için çanak düz bir yüzeye hafifçe dokunun. Tabaklar en az bir hafta boyunca oda sıcaklığında, rahatsız edilmeden oturun. Bir diseksiyon stereo mikroskobu altında, sinek ventral tarafı yukarı doğru yönlendirmek. Böcek pimleri kullanarak, toraks ve karın en arka ucundan başka bir iğne ile cinsel organ yakın bir iğne takarak plaka üzerine sinek pin(Şekil 2A). Diseksiyonu engellememek için numuneyi sabitlemeden önce pimleri ikiye kesmek yararlı olabilir. Diseksiyon plakası başına en fazla 10 sinek ile tekrarlayın.NOT: İsteğe bağlı: Plakaya uçup sabitlemeden önce kanatları ve bacakları çıkarın. Bu ortam eklendiğinde sinek etrafında oluşan bir kabarcık önlemeye yardımcı olacaktır. Tüm sinekler tabağa sabitlendikten sonra, bir transfer pipeti kullanarak sinekleri (~1 mL) kapsayacak kadar diseksiyon ortamı ekleyin. Forceps veya mite makas kullanarak, baş çıkarın. Miteklik makas kullanarak, iki yatay kesi ler yapmak: bir karın arka pin üzerinde doğrudan, ve karın en ön ucunda başka, nerede toraks ve karın karşılamak (Şekil 2B, C). Şekil2’de, baş yönünü netleştirmek için sağlam bırakılmıştır. İki yatay kesiyi birbirine bağlayan dikey bir kesi yapın (üç kesik I harfine benzer). Bu karın boşluğu açılacaktır (Şekil 2D). Forceps kullanarak, dorsal damar kaçınarak, iç organları ve doku kaldırmak. Eğer rahatsız edilmeden, şeffaf sırt damarı genellikle karın ön ucuna yakın zonklayan görülebilir. İlave iğneler, miğdelerin yeni kesilmiş uçlarını sabitlemek için kullanılabilir(Şekil 2E, F). Miğfif makas kullanarak, toraks çıkarın. Alternatif olarak, toraks bir mikroskop slayt üzerine diseksiyon lu cuticles ve dorsal damar montaj önce kaldırılabilir. Kalan sinekler ile tekrarlayın.  fagositik oranda olası varyasyonları en aza indirmek için, zamanında sinekler diseksiyon. Tüm sinekler kesildikten sonra, plakaya sabitlenmiş bağlı sırt damarı ile cuticles bırakın. 5. adımın tamamı diseksiyon plakasında yapılacaktır. Bu, adımlar arasında piriçlerin zarar vermesini veya yanlışlıkla atılmasını önler. 5. Fiksasyon ve boyama %4 paraformaldehit (PFA) ekli sırt damarı ile kesilen cuticles düzeltmek. Her adım için yeni bir tek kullanımlık aktarım pipeti kullanarak, diseksiyon ortamını atın ve 1 mL%4 PFA ile değiştirin. Fiksasyon ve boyama boyunca, diseksiyonları mümkün olduğunca ışıktan koruyun. 20 rpm sallanan ile 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bu doku zarar başlayabilir gibi diseksiyon, 20 dakikadan fazla fiksatif oturup izin vermeyin. 1x PBS + %0.1 Tween (PBST) içinde 2x cuticles yıkayın. Fiksatif çıkarın ve 1 x PBST 1 mL ile değiştirin. Sallayarak 15 dakika oda sıcaklığında yıkayın. 1x’i tekrarlayın.NOT: İncelenen sabit doku, ilk yıkamadan sonra taze PBST ile değiştirilerek ışıktan korunarak, 4 °C’de 3 güne kadar saklanabilir. Antikor lar kullanılacaksa sabit doku saklamayın. Antikorlar en iyi sonuçları için taze doku ile kullanılmalıdır. İsteğe bağlı: Antikor boyama. Antikorlar açıkça dorsal damar görselleştirmek için kullanılabilir (Şekil 3), veya hemosit spesifik belirteçleri tespit etmek için. Bu dorsal damar boyunca sadece hücrelerin sayılır veya hemositlerin membran işaretlemek için sağlayabilir. İkinci yıkama çıkarın, uygun seyreltme birincil antikor ekleyin. Gece boyunca 4 °C’de, sallanan. Birincil antikor çıkarın ve sallanan ile 15 dakika PBST ile iki kez yıkayın. Floresan ikincil antikor ekleyin. Floresan partikülleri gizlememesi için yeşil floresan antikor öneriyoruz. 2 saat oda sıcaklığında inkübül, sallanan ile. Sekonder antikor çıkarın, PBST ile her biri 15 dakika boyunca iki kez yıkayın. DAPI ile leke. Son yıkamayı çıkarın ve PBST’de seyreltilmiş 1 mL DAPI (1:1000) ile değiştirin. Oda sıcaklığında sallanan ile 20 dakika boyunca leke. DAPI’yi çıkarın ve 2x yıkayın (adımı 5.2’yi tekrarlayın). Son yıkamayı taze 1x PBST ile değiştirin.NOT: Sinekler 4 °C’de, ilk yıkamadan sonra taze PBST ile değiştirilerek ışıktan 3 güne kadar saklanabilir. 6. Mikroskop slaytlarına pirilerin montajı ve görüntüleme Kesilmiş piriçleri hazırlayın. Diseksiyon stereomikroskop altında, görüntüleme engelleyebilir aşırı mite kupülü kesti. Forceps kullanarak, bağlı sırt damarı ile cuticles transfer 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içeren 70% gliserol. Gliserol içinde cuticles yerleştirerek PBST kaldırmak yardımcı olacak ve görüntüleme sırasında daha net bir görüntü sağlar. Mikroskop slayt üzerine cuticles monte. Bir mikroskop slayt% 70 gliserol birkaç damla ekleyin. Forceps kullanarak, gliserol tüpünden cuticles kaldırmak ve slayt gliserol yer. Diseksiyon stereo mikroskobu altında, cuticles ventral tarafı yukarı yönlendirmek için forceps kullanın, dorsal damar görünür olmasını sağlamak. Miğdekoyu koyu pigment yüz üstü olacak. Gerekirse gliserol ek bir damla ekleyin. Bu hava kabarcıkları önlemeye yardımcı olur ve daha net bir görüntü sağlar. Hafifçe tırnak cilası ile cuticles ve mühür kenarları üzerinde bir coverslip yerleştirin. Devam etmeden önce 10-15 dakika kurumasını bekleyin. Sinekleri hemen görüntüleyin veya 4 °C’de ışık geçirmez bir kutuda saklayın. Dorsal damarı görüntüle. Floresan mikroskop kullanarak, dorsal damarın optik bölümleri oluşturmak için yapısal girişim sistemini kullanın. Bir konfokal mikroskop alternatif olarak ek doğruluk sağlayabilir kullanılabilir. 20x objektif ve tercih edilen görüntüleme yazılımı kullanarak sırt damarının Z-yığın görüntülerini elde edin. 10 mm’lik bir ölçek çubuğu ekleyin ve görüntüleri tiff dosyaları(Şekil 4)veya istenilen biçim olarak düzgün bir şekilde etiketleyin ve kaydedin.NOT: Elde edilen Z-stack görüntülerinin sayısı diseksiyonlar arasında farklılık gösterebilir ve dorsal kabın ne kadar iyi parçalara geçirildiklerine ve görüntüler arasında istenilen adım boyutuna bağlıdır. Burada, adım boyutu 0.49 mm olarak ayarlandı. Bu sayı, deneyimlerimizde yığın başına 3 ila 40 görüntü arasında değişebilir. 7. Görüntüleri analiz edin ImageJ kullanarak floresan olayları ölçün. Görüntüleri açın ve yığın: Resim à Stacks à Images to Stack. Her olaydan her biri sinek başına en az 10 hücreden, enjekte edilen parçacık türü başına yaş başına en az 10 sinekten tıklayarak, DAPI pozitif bir çekirdeğe odaklanmış 10 mm çapındaki 10 mm çapındaki floresan sinyalleri sayın: Eklentiler à Analyze à Hücre Sayıcı Bildirimi ( Şekil5A). Hücre karşı bildirim aracı izlenen her hücreye farklı bir renk atar ve bu hücre içinde tıklanan her floresan olaya karşılık gelen renkli bir nokta ile. Her noktayla ilişkili sayaç ve yığın konumunu listelemek için, Analiz sekmesi nin altında ‘m’ tuşuna basın veya Ölçüle’yi seçin veya her hücrede sayılan olay sayısını bir sonuç tablosunda görüntülemek için ‘alt +y'(Şekil 5B)tuşuna basın. Hücre sayımlarını istatistiksel analiz için kullanılacak bir elektronik tabloya aktarın. İstatistiksel analiz yapın. Sabit efektli ANOVA veya karma model iç içe geçmiş ANOVA’yı kullanarak fagositik olaylardaki farklılıkları analiz edin. Karışık modeller yaş ve genotip ve her genotip17içinde yuvalanmış bireylerin rasgele etkisini ana sabit etkilerini test etmek için kullanılabilir.NOT: Araştırmacılar, verileri analiz etmek için kullanılan herhangi bir istatistiksel yordamın varsayımlarını test etmede titiz olmalıdır.