Este protocolo descreve um ensaio in vivo da fagocitose utilizado para avaliar e quantificar a capacidade dos hemócitos de melanogaster de Drosophila jovens e envelhecidos para bactérias fagocitose..
A fagocitose é uma função essencial da resposta imune inata. Este processo é realizado por hemócitos fagocíticos cuja função primária é reconhecer uma ampla gama de partículas e destruir patógenos microbianos. À medida que os organismos envelhecem, esse processo começa a diminuir, mas pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes ou a base genética da imunosenescência. Aqui, uma injeção baseada em ensaio de fagocitose in vivo é utilizada para avaliar mudanças relacionadas à idade em diferentes aspectos da fagocitose, como ligação, engolamento e degradação de partículas internalizadas, quantificando eventos fagocícitos em hemócitos em Drosophila adulto. Drosophila melanogaster tornou-se um modelo ideal para investigar mudanças relacionadas à idade na função imunológica inata por muitas razões. Por um só, muitos componentes genéticos e funções da resposta imune inata, incluindo a fagocitose, são evolutivamente conservados entre drosophila e mamíferos. Por causa disso, os resultados obtidos com o uso deste protocolo provavelmente serão amplamente relevantes para a compreensão das mudanças relacionadas à idade na função imunológica em uma variedade de organismos. Além disso, observamos que este método fornece estimativas quantitativas da capacidade fagocítica hemocito, que poderia ser útil para uma variedade de tópicos de pesquisa, e não precisa se limitar a estudos de envelhecimento.
O sistema imunológico inato, que consiste em barreiras físicas e químicas à infecção, bem como componentes celulares, é conservado evolutivo entre organismos multicelulares1,,2. Como primeira linha de defesa, o sistema imunológico inato desempenha um papel crítico no combate a patógenos invasores em todos os animais1,,2,3. Os componentes da resposta imune inata incluem uma ampla gama de tipos de células que são classificadas com base na falta de especificidade e memória imunológica2,,3,,4. Em humanos, esses tipos de células incluem monócitos fácticos e macrófagos, neutrófilos e células assassinas naturais citotóxicas4,,5. Embora ter um sistema imunológico funcional seja imperativo para a sobrevivência do hospedeiro, é claro que a função das células imunes diminui com a idade, fenômeno conhecido como imunosenescência5,,6. Ser capaz de avaliar mudanças relacionadas à idade na resposta imune, incluindo diferentes aspectos do processo de fagocitose, poderia ajudar na nossa compreensão da imunosenescência. O procedimento que descrevemos aqui fornece uma abordagem eficaz e repetível para avaliar e quantificar eventos faócticos por hemócitos em Drosophila melanogaster.
A drosophila é um modelo ideal para estudar a resposta imune por muitas razões. Por um tempo, há um extenso conjunto de ferramentas genéticas disponíveis que tornam possível manipular facilmente a expressão genética de forma dependente de tecidos7. Essas ferramentas incluem uma coleção de mutantes, estoques de interferência de RNA, estoques GAL4/UAS e o Painel de Referência Genética Drosophila que contém 205 linhas de raça diferentes para as quais todas as sequências de genoma são catalogadas8. O curto ciclo de vida da Drosophila e o grande número de indivíduos produzidos permitem aos pesquisadores testar múltiplos indivíduos em um ambiente controlado, em um curto período de tempo. Isso melhora muito a capacidade de identificar diferenças sutis nas respostas imunes à infecção entre genótipos, entre sexos ou entre idades. É importante ressaltar que muitos componentes genéticos e funções da resposta imune inata, incluindo a fagocitose, são evolutivamente conservados entre drosophila e mamíferos1,2.
Em Drosophila, o processo de fagocitose que se segue à infecção é realizado por hemócitos fagocíticos chamados plasmatócitos, que equivalem aos macrófagosmamíferos 9. Os hemócitos são essenciais para reconhecer uma ampla gama de partículas e limpar patógenos microbianos9,,10,,11,12,13. Essas células expressam uma variedade de receptores que devem diferenciar-se do não-auto, e iniciar eventos de sinalização necessários para realizar o processo fagocítico10,,11,12,,13,,14,15. Uma vez que uma partícula é amarrada, ela começa a ser internalizada pela reorganização do citoesqueleto de actina e remodelação da membrana plasmática para expandir-se em torno da partícula, formando um copo fagocítico11,,12,,13,14. Durante esse processo, outro conjunto de sinais diz à célula para internalizar ainda mais a partícula, fechando o copo fagocítico, formando um fágora ligado à membrana11,,12,13,,14,15. O fágora passa então por um processo de maturação, associando-se com diferentes proteínas e fundindo-se com lisosomos, formando um fagolico ácido11,12,13,14,15. Neste ponto, as partículas podem ser degradadas e eliminadas de forma eficiente11,12,13,14,15. Estudos de drosophila revelaram que moscas mais velhas (4 semanas de idade) têm uma capacidade reduzida de limpar uma infecção em comparação com moscas mais jovens (1 semana de idade), provavelmente devido, pelo menos em parte, a um declínio em alguns aspectos da faagocitose16,17.
O método descrito aqui utiliza duas partículas E. coli com rótulos fluorescentes separados, uma com fluorohore padrão e outra sensível ao pH, para avaliar dois aspectos diferentes da fagocitose: o engolfamento inicial das partículas e a degradação das partículas no fagoliossomo. Neste ensaio, fluorescência fluoro-partícula é observável quando as partículas são amarradas e engolidas por hemócitos, enquanto partículas sensíveis ao pH fluorescem apenas nas baixas condições de pH do fagosome. Eventos fluorescentes podem então ser observados em hemócitos que se localizam ao longo do vaso dorsal. Focamos em hemócitos localizados no vaso dorsal, que fornecem um marco anatômico para localizar hemócitos que são conhecidos por contribuir para o despejo bacteriano, e para isolá-los consistentemente. No entanto, hemócitos em outras partes do corpo e hemoglifos também são importantes para a liberação. Embora não tenhamos estudado essa população celular, nosso procedimento geral pode ser aplicável para ensaios fagocíticos dessas células também. Uma vantagem de nossa abordagem é que podemos quantificar eventos fagocíticos dentro de hemócitos individuais, permitindo detectar variações sutis nos processos fagocíticos. Outros estudos que visualizam eventos fluorescentes através da cutícula18,19 não explicam as diferenças no número de hemócitos presentes, o que é especialmente importante considerar no nosso caso como a contagem total de hemócitos deve mudar com a idadede 17 anos.
O protocolo descrito aqui é uma maneira confiável de quantificar diferentes aspectos da faagocytose, sob condições experimentais controladas. Notamos que só testamos este procedimento com partículas bacterianas gram negativas e os resultados podem diferir se partículas bacterianas gram positivas forem usadas. De fato, seria interessante comparar as respostas fagocíticas com bactérias gram negativas e gram positivas em diferentes condições experimentais. O uso de um nano-injetor permite um controle preciso sobre os volumes de injeção, garantindo que cada mosca seja injetada com o mesmo volume de partículas. Uma limitação ao protocolo vem de inconsistências nas preparações de partículas. As partículas se agregarão uma vez congeladas, de modo que pequenas variações nos volumes de diluição, ou falta de vórtice, podem afetar a concentração de partículas entre experimentos. Para minimizar possíveis variações nas concentrações de partículas entre as idades, é benéfico injetar moscas de 1 e 5 semanas no mesmo dia, usando a mesma solução de agulha e partículas. Outra desvantagem potencial é que durante as dissecções, o vaso dorsal e/ou cutícula podem ser facilmente danificados se os pinos não forem manuseados corretamente. Para evitar interromper o vaso dorsal, minimize o número de pinos utilizados por dissecção. A vantagem deste método de dissecção é que todas as etapas de fixação, lavagem e coloração podem ser realizadas na placa de dissecção. Como as cutículas estão presas, isso evita que as cutículas se percam entre os passos.
Em comparação com os métodos existentes18,,19,,25,,26,,27,,28,,29, o protocolo descrito tem suas vantagens e limitações. Ao dissecar o vaso dorsal, somos capazes de visualizar e quantificar hemócitos individuais neste local. Isso permite detectar variações sutis na atividade fagocítica entre grupos experimentais. Outros métodos visualizam partículas fluorescentes rotuladas através da coleta de hemócitos usando um ensaio bleed/scrape19,25,26,27, ou através de uma cutícula ventral intacta18,19,28,29; no entanto, hemócitos individuais não podem ser avaliados quando visualizados através da cutícula dorsal. A vantagem deste protocolo, quando comparado ao método Bleed/Scrape é que nosso método nos permite avaliar apenas os hemócitos associados ao vaso dorsal, e explica as células circulantes ou aquelas ao longo da parede do corpo, que podem ser funcionalmente diferentes. Dissecar o vaso dorsal também remove a necessidade de incluir uma segunda rodada de injeções com uma fluorescência quencher, como trypan azul19,26. Isso ocorre porque todas as partículas não vinculadas ou engolidas por uma célula serão lavadas durante as etapas de lavagem. Por outro lado, métodos alternativos podem ser mais fáceis de executar porque não requerem dissecções. Embora dissecar o vaso dorsal seja fácil de aprender, esta etapa adiciona um nível de complexidade que pode não ser viável em alguns projetos experimentais.
Embora o uso descrito deste ensaio de fagocitose in vivo seja para avaliar e quantificar eventos fagocíticos entre diferentes idades, este protocolo é altamente adaptável e pode ser usado para analisar diferentes aspectos da fagocitose entre genótipo, sexo ou tipo de tecido. Com a fagocitose sendo de importância central para a maioria dos animais multicelulares, entender como esse processo diminui com a idade pode levar a melhores tratamentos terapêuticos para a população envelhecida. Essa abordagem oferece potencial de longo prazo para elucidar aspectos das mudanças relacionadas à idade na resposta imune, com foco especial na fagocitose.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde R03 AG061484-02 e do UmBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.
0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
35×10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
Glass slides | Premiere | D17026102 | |
Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55℃ Solenoid: 45 |
Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |