פרוטוקול זה מתאר בvivo של פאיגוציטוזה המשמש להערכת ולכמת את היכולת של דרוסופילה מלאנוזוזה בגיל צעיר ומיושן לחיידק הפאגוציטוז.
Phagocyציטוזה היא פונקציה חיונית של התגובה החיסונית מולדת. תהליך זה מבוצע על ידי הומוציטים phagocytic אשר תפקידה העיקרי הוא לזהות מגוון רחב של חלקיקים ולהרוס פתוגנים מיקרוביאלית. כמו בגיל האורגניזמים, תהליך זה מתחיל לרדת, אך מעט ידוע על המנגנונים הבסיסיים או את הבסיס הגנטי של החיסוני. כאן, זריקה המבוססת על הvivo של phagocyציטוזה משמש להערכת שינויים הקשורים גיל בהיבטים שונים של phagocyציטוזה, כגון קשירה, השפלה והשפלות של חלקיקי הפנפניט, על ידי החלפת אירועים מסוג phagocytosis ב הומוציטים אצל מבוגרים דרוזופילה. דרוזופילה מלאנוגסטר הפך למודל אידיאלי כדי לחקור שינויים הקשורים גיל בתפקוד החיסוני הטבוע מסיבות רבות. עבור אחד, מרכיבים גנטיים רבים ופונקציות של התגובה החיסונית מולדת, כולל phagocyציטוזה, הם שמרו אבולוציונית בין היונקים האלה. בגלל זה, התוצאות שהתקבלו משימוש בפרוטוקול זה צפויים להיות רלוונטיים באופן נרחב כדי להבין את גיל שינויים הקשורים בתפקוד החיסוני במגוון של אורגניזמים. בנוסף, אנו מודעים לכך ששיטה זו מספקת הערכות כמותיים של יכולת phagocytic, אשר יכול להיות שימושי עבור מגוון של נושאי מחקר, ולא צריך להיות מוגבל למחקרים של הזדקנות.
המערכת החיסונית הטבועה, המורכבת ממחסומים פיזיים וכימיים לזיהום, כמו גם רכיבים סלולריים, הוא שימור אבולוציוני על פני אורגניזמים רב-תאיים1,2. כמו קו ההגנה הראשון, מערכת החיסון מולדת משחק תפקיד קריטי במאבק הפולשים פתוגנים בכל החיות1,2,3. המרכיבים של התגובה החיסונית מולדת כוללים מגוון רחב של סוגי תאים אשר מסווגים על בסיס כי הם חסרים ספציפיות זיכרון אימונולוגיים2,3,4. בבני אדם, סוגי תאים אלה כוללים מונוציטים phagocytic ו מקרופאגים, נויטרופילים, ו ציטוטוקסיים טבעי הרוצח תאים4,5. בעוד שיש מערכת חיסונית תפקודית היא הכרחית עבור הישרדות מארח, ברור כי הפונקציה של תאים חיסוניים ירידות עם הגיל, תופעה הידועה בשם חיסוני5,6. היכולת להעריך את השינויים הקשורים בגיל בתגובה החיסונית, כולל היבטים שונים של תהליך של phagocyציטוזה, יכול לסייע ההבנה שלנו של המערכת החיסונית. ההליך שאנו מתארים כאן מספק גישה יעילה לשחזור להעריך ולכמת אירועים phagocytic ידי הומוציטים ב Drosophila ילה melanogaster.
דרוזופילה היא מודל אידיאלי לחקר התגובה החיסונית מסיבות רבות. עבור אחד, יש קבוצה נרחבת של כלים גנטיים זמינים אשר מאפשרים לתמרן בקלות ביטוי גנים בצורה תלוית רקמות7. כלים אלה כוללים אוסף של מוטציות, RNA הפרעות מניות, GAL4/UAS מניות, ואת Drosophila פאנל התייחסות גנטית המכילה 205 שונים שורות שונות שעבורן רצפי הגנום כולו מקוטלגים8. מחזור החיים הקצר של דרוסופילה והמספר הגדול של אנשים שיוצרו מאפשרים לחוקרים לבדוק אנשים מרובים בסביבה מבוקרת, בפרק זמן קצר. זה משפר מאוד את היכולת לזהות הבדלים עדינים בתגובות החיסונית לזיהום בין גנוטיפים, בין המינים או לאורך הגילאים. חשוב מכך, רכיבים גנטיים רבים ופונקציות של התגובה החיסונית מולדת, כולל phagocyציטוזה, הם שימור אבולוציונית בין מדרוזוהילה ויונקים1,2.
בדרוזופילה, תהליך הפייגוציטוזה הנובע מזיהום מבוצע על ידי המטוציטים phagocytosis המכונה פלמטוציטים, אשר שוות ערך למקפאגים של יונקים9. הומוציטים חיוניים לזיהוי מגוון רחב של חלקיקים וניקוי פתוגנים מחיידקים9,10,11,12,13. תאים אלה לבטא מגוון של קולטנים שחייבים להבדיל את עצמי מפני לא עצמית, וליזום אירועים איתות הדרושים כדי לבצע את התהליך phagocytic10,11,12,13,14,15. לאחר חלקיק מאוגד, הוא מתחיל להיות הפנימו על ידי ארגון משנה של שלד אקטין ושיפוץ של קרום פלזמה להתרחב סביב החלקיקים, ויצרו גביע phagocytic11,12,13,14. במהלך תהליך זה, קבוצה נוספת של אותות מורה לתא להפנים את החלקיקים עוד על ידי סגירת הגביע phagocytic, ויוצרים ממברנה מאוגד phagoכמה11,12,13,14,15. Phagosome לאחר מכן עובר תהליך התבגרות, שיוך עם חלבונים שונים ומיזוג עם ליסוזומים, ויצרו phagolyso, חומצי חומציים11,12,13,14,15. בשלב זה, חלקיקים יכולים ביעילות להיות מושפל ומסולק11,12,13,14,15. מחקרים דרוזוהילה חשפו כי זבובים מבוגרים יותר (4 שבועות של גיל) יש יכולת מופחתת לנקות זיהום בהשוואה לזבובים צעירים (בן שבוע אחד), כנראה בשל, לפחות בחלק, לירידה בהיבטים מסוימים של phagocyציטוזה16,17.
השיטה המתוארת כאן משתמשת בשני חלקיקים שאינם מתויג בחום של החיידק הקולי , האחד הנושא את מערכת האנטי-וולופפור הסטנדרטית, והוא בעל החומציות הרגישה, כדי להעריך שני היבטים שונים של פאגוציטוזה: הדבר הראשוני של חלקיקים, ואת השפלה של חלקיקים phagolyso, בתוך הקפדה זו, פלואורו-חלקיק פלואורסצנטית הוא הנצפה כאשר החלקיקים מאוגדים ונבלע על-ידי הומוציטים, ואילו חלקיקי ה-pH רגישים בלבד בתנאי ה-pH נמוך של phagosome. אירועי פלורסנט ניתן לצפות הומוציטים הנמצאים לאורך כלי הקיבול. אנו מתמקדים הומוציטים מקומי לכלי הקיבול, אשר מספקים נקודת ציון אנטומית לאתר הומוציטים אשר ידועים לתרום לסיווג חיידקי, ולבודד אותם בעקביות. עם זאת, הומוציטים בחלקים אחרים של הגוף המוליקמ הם גם חשובים עבור סיווג. למרות שאנחנו לא למדו את האוכלוסייה הזאת התאים, ההליך הכללי שלנו יכול להיות ישים עבור phagocytic בחני ספר של תאים אלה גם. אחד היתרונות של הגישה שלנו הוא שאנחנו יכולים לכמת אירועים phagocytic בתוך הומוציטים בודדים, המאפשר לנו לזהות וריאציה עדינה בתהליכים phagocytic. מחקרים אחרים המדמיינים את אירועי הפלורסנט דרך הקוטיקולה18,19 אין להתחשב בהבדלים במספרי הומוציטים הנוכחים, שחשוב במיוחד לשקול במקרה שלנו כספירות מוחלטת של הומוציטוט צפויים להשתנות עם הגיל17.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא דרך אמינה לכמת היבטים שונים של phagocyציטוזה, תחת תנאים ניסיוניים מבוקרת. אנו מודעים לכך יש לנו רק בדקנו את ההליך הזה עם חלקיקים בקטריאלי גראם שליליים ותוצאות עשויות להיות שונות אם חלקיקים בקטריאלי גראם חיוביים משמשים. אכן, זה יהיה מעניין להשוות את התגובות phagocytic הן חיידקים גרם שלילית גראם חיוביים בתנאים ניסיוניים שונים. השימוש בננו-מזרק מאפשר שליטה מדויקת על אמצעי הזרקה, ולהבטיח שכל זבוב מוזרק באותו נפח של חלקיקים. מגבלה אחת לפרוטוקול נובעת מחוסר עקביות בהכנות לחלקיקים. חלקיקים יהיה לצבור פעם קפואים, אז וריאציות קטנות בכמויות דילול, או חוסר vortexing, יכול להשפיע על ריכוז חלקיקים בין ניסויים. כדי למזער וריאציות אפשריות בריכוזי חלקיקים בין הגילאים, מועיל להזריק זבובים בני 1 ו-5 שבועות באותו היום, תוך שימוש באותו פתרון מחט וחלקיקים. חיסרון פוטנציאלי נוסף הוא שבמהלך הניתוח ניתן לפגוע בכלי הקיבול ו/או בקוטיקולה בקלות אם פינים אינם מטופלים כראוי. כדי להימנע מהפרעה לכלי הקיבול, יש למזער את מספר הפינים הנמצאים בשימוש בכל ניתוח. היתרון של שיטת הניתוח הוא כי כל קיבעון, שטיפת שלבים וכתמים ניתן לבצע בלוחית הניתוח. מכיוון שציפורנייך מוצמדים, פעולה זו מונעת את הציפורנייך מאיבוד בין שלבים.
בהשוואה לשיטות הקיימות18,19,25,26,27,28,29, לפרוטוקול המתואר יש יתרונות ומגבלות. על ידי מבתר את הכלי הגבי, אנו מסוגלים להמחיש ולכמת הומוציטים הפרט במיקום זה. זה מאפשר לזהות וריאציות עדינות בפעילות phagocytic בין קבוצות ניסיוני. שיטות אחרות להמחיש חלקיקים מתויג באופן שונה על ידי איסוף הומוציטים באמצעות בליד/שריטהבדקה19,25,26,27, או באמצעות קוטיקולה שלמה,18,19,28,29; עם זאת, הומוציטים בודדים לא ניתן להעריך כאשר דמיינו דרך הקוטיקולה הגבי. היתרון של פרוטוקול זה, כאשר בהשוואה לשיטת הבליד/שריטה הוא שהשיטה שלנו מאפשרת לנו להעריך רק את אותם הומוציטים הקשורים לכלי הקיבול, והיא מהווה חשבון למחזור תאים או לאלה שלאורך קיר הגוף, שעשויים להיות שונים מבחינה פונקציונלית. מבתר את הספינה התחתית גם מסיר את הצורך לכלול סיבוב שני של זריקות עם הקונקויום הפלואורסצנטית, כמו טרימין כחול19,26. הסיבה לכך היא כי כל החלקיקים לא מאוגד או נבלע על ידי תא יהיה שטף משם במהלך שטיפת שלבים. לעומת זאת, שיטות חלופיות עשויות להיות קלות יותר לביצוע מכיוון שהן אינן דורשות ניתוח. בעוד מבתר את הספינה התחתית קל ללמוד, שלב זה מוסיף רמה של מורכבות זה לא יכול להיות אפשרי בכמה עיצובים ניסיוניים.
למרות השימוש המתואר זה בשנת vivo phagocyציטוזה להעריך ולכמת אירועים phagocytosis בין גילאים שונים, פרוטוקול זה הוא מאוד להתאמה והוא יכול לשמש כדי לנתח היבטים שונים של phagocyציטוזה בין גנוטיפ, מין, או רקמה סוג. עם phagocyציטוזה להיות בעל חשיבות מרכזית עבור רוב בעלי חיים מטבעות, הבנת כיצד תהליך זה מסרב עם הגיל יכול להוביל טיפולים טיפוליים טובים יותר עבור אוכלוסיית ההזדקנות. גישה זו מציעה פוטנציאל לטווח ארוך להסבר היבטים של שינויים הקשורים לגיל בתגובה החיסונית, עם דגש מיוחד על phagocyציטוזה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות R03 AG061484-02 ואת המכללה המדע הטבעי והמתמטי של מדעי המדינה באלה דיקנסון הפקולטה קרן.
0.10 mm Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Here: pins are cut in half, and the sharp end is used |
1 mL sterile syringes | Becton Dickinson | 309602 | Filled with mineral oil to load needle |
15% Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | for dissection media |
16 % Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
3 mL Trasnfer Pipet | Falcon | 357524 | |
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | 1.14mm O.D X 3.5" length X 0.53" I.D |
35×10 mm Petri dishes | Becton Dickinson | 351008 | Used as dissection plate, filled half way with Sylgard |
6x penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | for dissection media |
70% Glycerol | Sigma | G9012 | |
Analog Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Biological point forceps, Dumont No. 5 | Fine Science Tools | 11295-10 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Life Technologies | D1306 | Diluted 1:1000 in 1x PBST |
Drosophila strain | w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8 | ||
E. coli (K-12 strain) BioParticles™, Alexa Fluor™ 594 conjugate | Life Technologies | E23370 | |
Glass slides | Premiere | D17026102 | |
Live cell imaging solution | Life Technologies | A14291DJ | preferred buffer for particle preparation and dilutions |
Mineral oil | Mpbio | 194836 | |
Nanoject II automatic nanoliter injector | Drummond | 3-000-204 | |
Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials | Genesee | 32-116SB | Size: 25 X 95 mm |
Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | Speed used: 20 rpm |
pHrodo™ Red E. coli BioParticles™ Conjugate for Phagocytosis | Life Technologies | P35361 | |
Schneider's Drosophila cell culture media (1x) | Gibco | 21720-024 | Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 2mM (or 20%) working |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Sylgard 184 Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Prepare according to provided protocol |
Tween 20 | Sigma | P1379 | For PBS + 0.1% tween |
Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 812368 | Heater: 55℃ Solenoid: 45 |
Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope | Zeiss | Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software |