Evaluación de la capacidad fagocítica específica por edad de los hemocitos de Drosophila melanogaster adultos utilizando un ensayo de fagocitosia In Vivo

1. Recoger y envejecer Drosophila Para generar las mismas moscas F1 envejecidas para analizar la fagocitosis, agregue 5-10 hembras vírgenes y 5 machos de los genotipos apropiados a un vial que contenga alimentos frescos para moscas. Utilizamos un alimento a base de melaza de harina de maíz20,pero el método debe funcionar independientemente del tipo de dieta en la que se crían las moscas. Para este experimento utilizamos Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP vuela para etiquetar hemocitos genéticamente.NOTA: Se pueden utilizar más moscas, pero algunas líneas de D. melanogaster pueden no aparearse o reproducirse bien cuando están superpobladas, y el hacinamiento puede tener efectos adversos en el desarrollo larvario21 y la fagocitosis. Mantener las moscas bajo las condiciones experimentales deseadas. Para este experimento, mantenga He-GAL4; UAS-GFP vuela a 24oC. Permita que las moscas adultas se aparees durante una semana y luego retire a los adultos. Las moscas F1 se recogerán de estos viales después de la eclosión para uso experimental. Recoger moscas vírgenes durante toda la semana, o hasta que se recoja el número deseado de moscas. Las vírgenes no son necesarias; sin embargo, el apareamiento puede afectar la respuesta inmune. Si las moscas F1 deben ser probadas como vírgenes, separe a los machos y a las hembras dentro de las 8 horas posteriores a la eclosión y mantengadas en viales separados para evitar el apareamiento. Recoger suficientes moscas para permitir la evaluación de la fagocitosis en al menos 10 moscas por genotipo/tratamiento/sexo por edad. Si envejece las moscas a una semana, recoja al menos 50 moscas en total, o 20 moscas por condición de tratamiento para cada partícula, ya sea partículas fluoroelédicas o partículas sensibles al pH, que se inyectarán. Esto asegurará un mínimo de 10 moscas para ensayar en el momento del experimento. Si el envejecimiento vuela a más de 3 semanas, recoja al menos 100-150 moscas en total, o 50-75 moscas por condición de tratamiento para asegurarse de que hay suficientes moscas disponibles para medir la fagocitosis. Cuando envejece vuela en el laboratorio, normalmente usamos jaulas de insectos mantenidas a 24 oC en 12:12 L:D condiciones, y cambiar la comida cada dos días. Si se utilizan viales en lugar de jaulas, la punta vuela en viales nuevos cada 3-5 días, dependiendo del estado de los alimentos en el vial. El número de moscas necesarias dependerá de la tardación en la edad en que se analice la fagocitosis, y de las tasas de supervivencia específicas de la edad de ese genotipo en una condición ambiental determinada. Si se evaluarán las moscas jóvenes y envejecidas, planifique en consecuencia para que las moscas de 1 semana de edad y envejecidas se inyecten el mismo día. Esto minimizará las variaciones en la concentración de partículas entre experimentos y asegurará que el efecto de la edad en la medición fagocítica no se confunda con el efecto del día en que se realizó el ensayo. Casa las moscas recogidas a 24 oC hasta que tengan 5-7 días de edad, o mantener las moscas a la edad deseada. 2. Preparar partículas con etiqueta fluorescente Reconstituir las partículas de E. coli o partículas de E. coli sensibles al pH a una concentración de 20 mg/ml o 1 mg/ml, respectivamente. Otras bacterias están disponibles para su uso que pueden ser más adecuados para ciertos experimentos, pero consulte las instrucciones del fabricante para las concentraciones de stock adecuadas. En el sentido de las partículas fluoradas, añada 990 l de 1x PBS (pH 7.4) o tampón preferido y 10 l de 2 mM (20%) azida sódica. Vórtice para mezclar.NOTA: El azida sódica es un conservante que puede omitirse; sin embargo, las partículas preparadas sin azida sódica no duran tanto. Las partículas fluoroelécticas deben utilizarse en un plazo de 24 horas y las partículas sensibles al pH deben utilizarse en un plazo de 7 días. Para partículas sensibles al pH, añada 1.980 ml de 1x PBS (pH 7.4) o tampón preferido y 20 ml de 2 mM (20%) azida sódica. Vórtice para mezclar. Haga múltiples alícuotas de un solo uso de 20 ml en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Almacene las partículas fluoro a -20 oC durante un año, y las partículas sensibles al pH a 4 oC durante un máximo de 6 meses, protegidas de la luz. El día de las inyecciones, retire el azida sódica de las partículas antes de su uso. Para ello, centrifugar las partículas durante 5 min a 15.000 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y lave las partículas dos veces resuspendiendo en 50 l de 1x PBS o tampón preferido, y centrífuga durante 5 min a 15.000 x g. Después del segundo lavado, retire las partículas sobrenadantes y resuspendidas en 100 l de 1x PBS o tampón preferido. Mantenga la solución en el tubo y minimice la exposición a la luz durante todo el experimento. Una vez que se elimina el azida sódica, utilice fluoropartas en un plazo de 24 h y utilice partículas sensibles al pH utilizadas en un plazo de 5-7 días.NOTA: En nuestros experimentos anteriores, descubrimos que esta concentración de partículas proporcionaba un número contable de eventos fagocíticos y que el número de partículas disponibles para la fagocitosis por los hemocitos no limitaba17. Sin embargo, los usuarios de este protocolo pueden querer comparar los resultados utilizando otras concentraciones para asegurarse de que hay un número adecuado de partículas disponibles para la fagocitosis por hemocitos en las condiciones de sus experimentos. Si se omitió el azida sódica, diluya las partículas 1:5 en el mismo tampón con el que se prepararon las partículas, para las inyecciones. Agregue una gota de colorante de alimentos verdes a las partículas. Esto hace que sea más fácil asegurarse de que las moscas se han inyectado. 3. Inyecte las moscas Prepare agujas de vidrio para inyecciones. Tire de las agujas de vidrio con un tirador de pipetas. Ajuste el calentador del tirador de pipeta a 55 oC y el solenoide a 45. Utilice únicamente las agujas provistas con el inyector, ya que no se garantiza que otras agujas funcionen con la misma precisión. Llene una jeringa estéril de 1 ml con aceite mineral y adjunte la aguja hipodérmica (G) del calibre 30, provista del nanoinyector. Rellene la aguja capilar tirada insertando la aguja de 30 G en el extremo romo de la aguja de vidrio tirado y llene con aceite mineral. Retire lentamente la aguja de 30 G, asegurándose de que no haya burbujas de aire en toda la aguja, ya que esto puede causar volúmenes de inyección inexactos. El inyector no funcionará correctamente sin rellenar la aguja. Con fórceps, rompa la punta de la aguja para crear una abertura que permita la expulsión de la solución. Montar el nano-inyector.NOTA: Se pueden utilizar otros inyectores. El método descrito a continuación se aplica al nanoinyector. Para otros inyectores, consulte el manual del usuario para obtener instrucciones. Ajuste el inyector al volumen deseado (entre 46 nL y 69 nL). Retire el collet y coloque la junta tórica de sellado, el espaciador blanco con la sangría hacia arriba para recibir el extremo posterior de la aguja, y la junta tórica más grande en el émbolo de metal, en ese orden. Vuelva a colocar la pinza sin apretarla. Inserte el émbolo metálico en el extremo romo de la aguja de vidrio llena de aceite. Empuje suavemente la aguja hacia abajo, insertándola en la junta tórica más grande. Apriete la pinza hasta que esté segura.NOTA: Si el émbolo metálico no se extiende más allá de la pinza, mantenga pulsado ‘EMPTY’ hasta que el émbolo esté visible. Esto facilita la inserción del émbolo en la aguja. Mantenga pulsado ‘EMPTY’ hasta que el inyector sue un pitido. Esto expulsa la mayor parte del aceite mineral de la aguja, dejando un pequeño volumen de aceite para actuar como una barrera entre los dos líquidos, así como elimina las burbujas de aire. Llene la aguja con partículas fluoropartas o partículas sensibles al pH insertando la punta de la aguja de vidrio en el tubo de microcentrífuga que contiene las partículas preparadas. Mantenga pulsado ‘FILL’ hasta que el inyector sue un pitido. Inyecciones Transfiera las moscas que se van a inyectar en un vial vacío. Inmovilizar las moscas colocando el vial en hielo. El CO2 también se puede utilizar para inmovilizar a las moscas. Sin embargo, tenga en cuenta que, cuando se utilizan partículas sensibles al pH, los niveles elevados deCO2 pueden acidificar artificialmente cualquier búfer que se utilice y puede elevar la fluorescencia de fondo. Inyectar las moscas en la placa esteropleural del tórax (Figura 1A). La inyección es exitosa si se ve tinte verde entrando en la marcha(Figura 1B). Si la mosca no se vuelve verde, asegúrese de que la aguja no esté obstruida.NOTA: Alternativamente, las moscas se pueden inyectar en el abdomen, pero mantener el lugar de inyección consistente en todos los experimentos. Coloque las moscas inyectadas en un vial de alimentos nuevo, observando el momento en que se inyectó la primera y la última mosca. Para minimizar el error experimental debido a la cantidad de tiempo que se tarda en completar las inyecciones, inyecciones completas de manera oportuna. Con la práctica, no debe tomar más de 10 minutos para inyectar un conjunto de moscas. Colocar el vial de lado hasta que todas las moscas se hayan recuperado, para evitar que las moscas se atasquen en el alimento. Permita que las moscas se recuperen durante 60-90 min, dependiendo de las condiciones experimentales. Aquí, se utilizó un tiempo de recuperación de 60 minutos. Tenga en cuenta que este intervalo de tiempo de recuperación fue óptimo para contar eventos fagocíticos en las condiciones experimentales en el estudio Horn et al.17. Sin embargo, en algunas condiciones, esto puede ser demasiado largo para detectar diferencias sutiles en la fagocitosis entre los grupos de tratamiento. Puede ser útil llevar a cabo experimentos de curso de tiempo como se hizo anteriormente17 para determinar el tiempo de recuperación que revelará las diferencias máximas entre el control y los resultados experimentales. Sea cual sea el tiempo de recuperación elegido, mantenga esto consistente en todos los tratamientos experimentales. Si se inyecta con partículas fluoropartas y partículas sensibles al pH el mismo día, utilice una aguja nueva para cada solución. No inyecte moscas individuales con ambas partículas si ambas fluoresce rojo, ya que el resultado no diferenciaría entre los dos aspectos de la fagocitosis, la unión/engullimiento de partículas frente a la inclusión de partículas en el fagoso. 4. Disección del vaso dorsal Después de que las moscas se hayan recuperado durante 60-90 minutos, transfiera todas las moscas vivas a un vial vacío e inmovilice sobre hielo. Transfiera una mosca a la vez a una placa de disección de elastómero de silicona.NOTA: Prepare las placas de disección al menos 1 semana antes de su uso, si se cura a temperatura ambiente. Para ello, prepara el elastómero y vierte en un plato Petri de 33 mm x 10 mm, llenando el plato a mitad de camino. Toque suavemente el plato sobre una superficie plana para minimizar las burbujas de aire. Deje que los platos se sienten a temperatura ambiente, sin perturbaciones, durante al menos una semana. Bajo un microscopio estéreo diseccionado, oriente el lado ventral de la mosca hacia arriba. Usando alfileres de insectos, fijar la mosca en la placa insertando un alfiler a través del tórax y otro alfiler a través del extremo más posterior del abdomen, cerca de los genitales (Figura 2A). Puede ser útil cortar los pasadores por la mitad antes de fijar la muestra para no obstruir la disección. Repita con hasta 10 moscas por placa de disección.NOTA: Opcional: Retire las alas y las patas antes de fijar la mosca a la placa. Esto ayudará a evitar que se forme una burbuja alrededor de la mosca cuando se agregan medios. Una vez que todas las moscas han sido fijadas a la placa, agregue suficiente medio de disección para cubrir las moscas (1 ml) usando una pipeta de transferencia. Con fórceps o tijeras de cutícula, retire la cabeza. Usando tijeras de cutícula, haga dos incisiones horizontales: una directamente por encima del pasador posterior en el abdomen, y otra en el extremo más anterior del abdomen, donde el tórax y el abdomen se encuentran(Figura 2B, C). En la Figura 2,la cabeza se dejó intacta para aclarar la orientación. Haga una incisión vertical, conectando las dos incisiones horizontales (los tres cortes se asemejan a la letra I). Esto abrirá la cavidad abdominal(Figura 2D). Usando fórceps, retire los órganos internos y el tejido, evitando el vaso dorsal. Si no se perturba, el vaso dorsal transparente a menudo se puede ver pulsando cerca del extremo anterior del abdomen. Se pueden utilizar pasadores adicionales para fijar los extremos de corte recién cortados de la cutícula(Figura 2E, F). Con tijeras de cutícula, retire el tórax. Alternativamente, el tórax se puede quitar antes de montar las cutículas diseccionadas y el vaso dorsal en un portaobjetos del microscopio. Repita con las moscas restantes.  diseccionar vuela de manera oportuna, para minimizar las posibles variaciones en la tasa fagocítica. Una vez que todas las moscas han sido diseccionadas, deje las cutículas con el vaso dorsal adjunto fijado a la placa. Todo el paso 5 se llevará a cabo en la placa de disección. Esto evitará dañar o descartar accidentalmente las cutículas entre pasos. 5. Fijación y tinción Fijar cutículas diseccionadas con vaso dorsal adjunto en 4% de paraformaldehído (PFA). Usando una nueva pipeta de transferencia desechable para cada paso, deseche el medio de disección y sustitúyalo con 1 ml de 4% de PFA. A lo largo de la fijación y tinción, mantenga las disecciones protegidas de la luz tanto como sea posible. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min con balanceo a 20 rpm. No permita que las disecciones se sienten en fijador durante más de 20 minutos, ya que esto podría comenzar a dañar el tejido. Lavar las cutículas 2x en 1x PBS + 0.1% Tween (PBST). Retire el fijador y sustitúyalo con 1 ml de 1x PBST. Lavar a temperatura ambiente durante 15 minutos con balanceo. Repita 1x.NOTA: El tejido fijo diseccionado se puede almacenar a 4 oC, durante un máximo de 3 días, protegido de la luz, después del primer lavado reemplazando el lavado por PBST fresco. No almacene tejido fijo si se utilizarán anticuerpos. Los anticuerpos se deben utilizar con tejido fresco para obtener mejores resultados. Opcional: Tinción de anticuerpos. Los anticuerpos se pueden utilizar para visualizar claramente el vaso dorsal(Figura 3),o para detectar marcadores específicos de hemocitos. Esto puede asegurar que sólo se cuenten las células a lo largo del vaso dorsal o para marcar la membrana de los hemocitos. Retire el segundo lavado, agregue el anticuerpo primario a la dilución adecuada. Incubar durante la noche a 4oC, balanceándose. Retire el anticuerpo primario y lave dos veces con PBST durante 15 minutos con balanceo. Añadir anticuerpo secundario fluorescente. Recomendamos un anticuerpo verde-fluorescente para que no oscurezca las partículas fluorescentes. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h, con balanceo. Retire el anticuerpo secundario, lave dos veces durante 15 minutos cada uno con PBST. Mancha con DAPI. Retire el lavado final y sustitúyalo con 1 ml de DAPI diluido en PBST (1:1000). Mancha durante 20 min con balanceo a temperatura ambiente. Retire DAPI y lávelo 2x (repita el paso 5.2). Sustituya el lavado final por PBST 1x fresco.NOTA: Las moscas se pueden almacenar a 4 oC, durante un máximo de 3 días, protegidas de la luz, después del primer lavado reemplazando el lavado por PBST fresco. 6. Montaje de cutículas en diapositivas de microscopio e imágenes Prepare las cutículas diseccionadas. Bajo el estereomicroscopio diseccionando, corte el exceso de cutícula que podría interferir con la toma de imágenes. Usando fórceps, transfiera las cutículas con recipiente dorsal adjunto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 70% de glicerol. Colocar las cutículas en glicerol ayudará a eliminar PBST y permite una imagen más clara durante la toma de imágenes. Monte las cutículas en el portaobjetos del microscopio. Añadir unas gotas de 70% de glicerol a un portaobjetos. Con fórceps, retire las cutículas del tubo de glicerol y colóquelo en el portaobjetos. Bajo el microscopio estéreo diseccionante, utilice fórceps para orientar las cutículas del lado ventral hacia arriba, asegurando que el vaso dorsal sea visible. El pigmento más oscuro de la cutícula estará boca abajo. Agregue una gota adicional de glicerol, si es necesario. Esto ayuda a prevenir las burbujas de aire y permite una imagen más clara. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre las cutículas y los bordes del sello con esmalte de uñas. Dejar secar durante 10-15 minutos antes de proceder. Imágenes de las moscas inmediatamente o guárdase en una caja a prueba de luz a 4 oC. Imagen del vaso dorsal. Usando un microscopio fluorescente, utilice el sistema de interferencia estructural para generar secciones ópticas del recipiente dorsal. Alternativamente, se puede utilizar un microscopio confocal que puede proporcionar precisión adicional. Obtenga imágenes de la pila Z del recipiente dorsal utilizando un software de imagen objetivo 20x y preferido. Agregue una barra de escala de 10 mm y etiquete y guarde correctamente las imágenes como archivos tiff (Figura 4) o el formato deseado.NOTA: El número de imágenes de la pila Z obtenidas puede variar entre las disecciones y depende de qué tan bien se diseccionó el recipiente dorsal, y del tamaño de paso deseado entre las imágenes. Aquí, el tamaño del paso se estableció en 0,49 mm. Ese número puede variar entre 3 y 40 imágenes por pila en nuestra experiencia. 7. Analizar imágenes Cuantifique los eventos fluorescentes con ImageJ. Abra las imágenes y apil á: Imagen , Pilas, à Imágenes a la pila. Cuente sólo las señales fluorescentes de 1 mm de tamaño dentro de un diámetro de 10 mm centrado en un núcleo daPI positivo haciendo clic en cada evento de al menosFigure 5A10 células por mosca, de al menos 10 moscas por edad por tipo de partícula inyectado: Plugins . à La herramienta de aviso de contador de celdas asigna un color diferente a cada celda rastreada, con un punto de color que corresponde a cada evento fluorescente en el que se hace clic dentro de esa celda. Para enumerar el contador y la posición de la pila asociadas a cada punto, pulse ‘m’ o seleccione Medir en la pestaña Analizar, o para mostrar el número de eventos contados en cada celda en una tabla de resultados, presione ‘alt +y’ (Figura 5B). Transfiera los recuentos de celdas a una hoja de cálculo que se utilizará para el análisis estadístico. Realizar análisis estadísticos. Analice las diferencias en los eventos fagocíticos utilizando ANOVA de efectos fijos o ANOVA anidado de modelo mixto. Los modelos mixtos se pueden utilizar para probar los principales efectos fijos de la edad y el genotipo y el efecto aleatorio de los individuos anidados dentro de cada genotipo17.NOTA: Los investigadores deben ser rigurosos al probar los supuestos de cualquier procedimiento estadístico utilizado para analizar los datos.