Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay

1. Verzamelen en leeftijd Drosophila Om dezelfde verouderde F1-vliegen te genereren voor het testen van fagocytose, voeg 5-10 maagdelijke vrouwtjes en 5 mannetjes van de juiste genotypen toe aan een flacon met vers vliegvoedsel. We gebruiken een maïsmeel melasse agar gebaseerd voedsel20,maar de methode moet werken, ongeacht het type dieet van de vliegen worden gekweekt. Voor dit experiment gebruikten we Hemese (Hij)-GAL4; UAS-GFP vliegt om hemocyten genetisch te labelen.OPMERKING: Meer vliegen kunnen worden gebruikt, maar sommige lijnen van D. melanogaster kan niet paren of reproduceren goed wanneer overvol, en overbevolking kan nadelige effecten hebben op larve ontwikkeling21 en fagocytose. Onderhoud vliegen onder de gewenste experimentele omstandigheden. Voor dit experiment, onderhouden He-GAL4; UAS-GFP vliegt bij 24 °C. Laat volwassen vliegen om te paren voor een week, en verwijder dan volwassenen. F1 vliegen zullen dan worden verzameld uit deze flesjes na eclosion voor experimenteel gebruik. Verzamel maagdelijke vliegen gedurende de week, of totdat het gewenste aantal vliegen worden verzameld. Maagden zijn niet nodig; paring kan echter van invloed zijn op de immuunrespons. Als F1 vliegen moeten worden getest als maagden, scheiden mannetjes en vrouwtjes binnen 8 uur na de sluiting en onderhouden in aparte flesjes om paring te voorkomen. Verzamel voldoende vliegen om de beoordeling van fagocytose mogelijk te maken bij ten minste 10 vliegen per genotype/behandeling/geslacht per leeftijd. Als de veroudering van de vliegen tot een week, verzamelen ten minste 50 vliegen in totaal, of 20 vliegen per behandeling voorwaarde voor elk deeltje, hetzij fluor-deeltjes of pH-gevoelige deeltjes, worden geïnjecteerd. Dit zorgt voor een minimum van 10 vliegen om te testen op het moment van het experiment. Als veroudering vliegt tot meer dan 3 weken, verzamelen ten minste 100-150 vliegen in totaal, of 50-75 vliegen per behandeling voorwaarde om ervoor te zorgen dat er genoeg vliegen beschikbaar zijn om fagocytose te meten. Bij veroudering vliegen in het laboratorium, gebruiken we meestal insectenkooien gehandhaafd op 24 °C in 12:12 L:D voorwaarden, en verander het voedsel om de andere dag. Als flacons worden gebruikt in plaats van kooien, tip vliegt in nieuwe flesjes om de 3-5 dagen, afhankelijk van de toestand van het voedsel in de flacon. Het aantal benodigde vliegen zal afhangen van hoe laat in leeftijd fagocytose zal worden geanalyseerd, en de leeftijd-specifieke overlevingskansen van dat genotype in een bepaalde milieu-conditie. Als jonge en oude vliegen zullen worden beoordeeld, plan dienovereenkomstig zodat 1 weken oude en oude vliegen zal worden geïnjecteerd op dezelfde dag. Dit minimaliseert variaties in deeltjesconcentratie tussen experimenten en zorgt ervoor dat het effect van leeftijd op de fagocytische meting niet verward is met het effect van de dag waarop de test werd uitgevoerd. Huis de verzamelde vliegen op 24 °C tot ze 5-7 dagen oud zijn, of onderhouden van de vliegen op de gewenste leeftijd. 2. Bereid fluorescerend gelabelde deeltjes Reconstitueer met warmte gedode E. coli fluordeeltjes of pH-gevoelige E. coli-deeltjes tot een voorraadconcentratie van respectievelijk 20 mg/mL of 1 mg/mL. Andere bacteriën zijn beschikbaar voor gebruik die geschikter kunnen zijn voor bepaalde experimenten, maar verwijzen naar de instructies van de fabrikant voor de juiste voorraadconcentraties. Voeg voor fluordeeltjes 990 μL 1x PBS (pH 7.4) of voorkeursbuffer en 10 μL van 2 mM (20%) toe natriumadeide. Vortex om te mengen.OPMERKING: Natriumaing is een conserveermiddel dat kan worden weggelaten; Echter, deeltjes bereid zonder natrium azide niet zo lang duren. Fluordeeltjes moeten binnen 24 uur worden gebruikt en pH-gevoelige deeltjes moeten binnen 7 dagen worden gebruikt. Voeg voor pH-gevoelige deeltjes 1.980 μL 1x PBS (pH 7.4) of voorkeursbuffer en 20 μL van 2 mM (20%) toe natriumadeide. Vortex om te mengen. Maak meerdere 20 μL-aliquoten voor eenmalig gebruik in microcentrifugebuizen van 1,5 mL. Bewaar fluordeeltjes tot een jaar bij -20 °C en pH-gevoelige deeltjes bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden, beschermd tegen licht. Verwijder op de dag van de injecties natriumaedide uit de deeltjes voor gebruik. Om dit te doen, centrifugeren de deeltjes gedurende 5 min op 15.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant en was deeltjes twee maal door resuspending in 50 μL van 1x PBS of voorkeur buffer, en centrifuge gedurende 5 min op 15.000 x g. Verwijder na de tweede wasbeurt de supernatant en resuspend deeltjes in 100 μL van 1x PBS of voorkeursbuffer. Houd de oplossing in de buis en minimaliseer de blootstelling aan licht tijdens het experiment. Zodra het natriumaside is verwijderd, gebruik fluordeeltjes binnen 24 uur en gebruik pH-gevoelige deeltjes die binnen 5-7 dagen worden gebruikt.OPMERKING: In onze eerdere experimenten, vonden we dat deze concentratie van deeltjes telbare aantallen fagocytische voorvallen en dat het aantal deeltjes beschikbaar voor fagocytose door hemocyten was nietbeperkend 17. Gebruikers van dit protocol kunnen echter resultaten willen vergelijken met behulp van andere concentraties om ervoor te zorgen dat er een voldoende aantal deeltjes beschikbaar is voor fagocytose door hemocyten in de omstandigheden van hun experimenten. Als natriumainge werd weggelaten, verdun de deeltjes 1:5 in dezelfde buffer waarmee de deeltjes werden bereid, voor injecties. Voeg een druppel (~ 10 μL) van groene kleurstof toe aan de deeltjes. Dit maakt het gemakkelijker om ervoor te zorgen dat de vliegen zijn geïnjecteerd. 3. Injecteer de vliegen Bereid glazen naalden voor op injecties. Trek glazen naalden met behulp van een pipet trekker. Zet de pipettrekker kachel op 55 °C en de solenoïde op 45. Gebruik alleen de naalden die bij de injector zijn geleverd, omdat het niet gegarandeerd is dat andere naalden met dezelfde precisie werken. Vul een 1 mL steriele spuit met minerale olie en bevestig de 30-meter hypodermische (G) naald, voorzien van de nano-injector. Vul de getrokken capillaire naald door het inbrengen van de 30 G naald in het stompe uiteinde van de getrokken glazen naald en vul met minerale olie. Verwijder de naald van 30 G langzaam, zodat er geen luchtbellen in de naald zijn, omdat dit onjuiste injectievolumes kan veroorzaken. De injector werkt niet goed zonder de naald bij te vullen. Met behulp van tangen, breken de punt van de naald om een opening te creëren om uitwerping van de oplossing mogelijk te maken. Monteer de nano-injector.LET OP: Andere injectoren kunnen worden gebruikt. De onderstaande methode is van toepassing op de nano-injector. Raadpleeg voor andere injectoren de gebruikershandleiding voor instructies. Stel de injector in op het gewenste volume (tussen 46 nL en 69 nL). Verwijder de collet en plaats de afdichting O-ring, de witte spacer met de inkeping naar boven om de achterkant van de naald te ontvangen, en de grotere O-ring op de metalen zuiger, in die volgorde. Herknaak de collet zonder het aan te scherpen. Steek de metalen zuiger in het stompe uiteinde van de met olie gevulde glazen naald. Duw de naald voorzichtig naar beneden en plaats deze in de grotere O-ring. Draai collet tot ze veilig zijn.LET OP: Als de metalen zuiger niet voorbij de collet loopt, houdt u ‘LEEG’ ingedrukt totdat de zuiger zichtbaar is. Dit maakt het gemakkelijker om ervoor te zorgen dat de zuiger in de naald wordt gestoken. Houd ‘LEEG’ ingedrukt totdat de injector piept. Dit werpt het grootste deel van de minerale olie uit de naald, waardoor een klein volume van de olie te fungeren als een barrière tussen de twee vloeistoffen, evenals verwijdert luchtbellen. Vul de naald met fluordeeltjes of pH-gevoelige deeltjes door de punt van de glasnaald in de microcentrifugebuis met de bereide deeltjes te plaatsen. Houd ‘FILL’ ingedrukt tot de injector piept. Injecties Breng de vliegen die moeten worden geïnjecteerd in een lege flacon. Immobiliseer de vliegen door de flacon in ijs te plaatsen. CO2 kan ook worden gebruikt om de vliegen te immobiliseren. Houd er echter rekening mee dat bij het gebruik van pH-gevoelige deeltjes verhoogde CO2-niveaus buffers die worden gebruikt kunstmatig kunnen verzuren en achtergrondfluorescentie kunnen verheffen. Injecteer de vliegen in de achterstevenopleurale plaat van de thorax (Figuur 1A). De injectie is succesvol als groene kleurstof wordt gezien gaan in de vlieg(Figuur 1B). Als de vlieg niet groen wordt, zorg er dan voor dat de naald niet verstopt is.OPMERKING: Als alternatief kunnen vliegen in de buik worden geïnjecteerd, maar houd de injectieplaats consistent in alle experimenten. Plaats geïnjecteerd vliegen in een nieuw voedsel flesje, wijzend op de tijd dat de eerste en laatste vlieg werd geïnjecteerd. Om experimentele fouten te minimaliseren vanwege de hoeveelheid tijd die nodig is om injecties te voltooien, voltooien injecties tijdig. Met de praktijk, moet het niet langer dan 10 minuten duren om een set van vliegen te injecteren. Leg de flacon op zijn kant totdat alle vliegen zijn hersteld, om te voorkomen dat de vliegen vast komen te zitten in het voedsel. Laat vliegen 60-90 minuten herstellen, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Hier werd een hersteltijd van 60 minuten gebruikt. Merk op dat dit hersteltijdbereik optimaal was voor het tellen van fagocytische voorvallen in de experimentele omstandigheden in de Horn et al. studie17. Echter, onder sommige omstandigheden, dit kan te lang zijn om subtiele verschillen in fagocytose tussen behandelingsgroepen op te sporen. Het kan nuttig zijn om experimenten met tijdsloop uit te voeren zoals eerder17 werd gedaan om de hersteltijd te bepalen die maximale verschillen tussen controle en experimentele resultaten zal onthullen. Welke hersteltijd ook wordt gekozen, houd dit consistent in alle experimentele behandelingen. Gebruik bij het injecteren met fluordeeltjes en pH-gevoelige deeltjes op dezelfde dag een nieuwe naald voor elke oplossing. Injecteer geen individuele vliegen met beide deeltjes als ze allebei fluorescerend rood, omdat het resultaat geen onderscheid zou maken tussen de twee aspecten van fagocytose, deeltjesbinding/engulfment vs. deeltjesopname in het fagosoom. 4. Ontleden van het rugvat Nadat vliegen zijn hersteld voor 60-90 min, breng alle levende vliegen naar een lege flacon en immobiliseren op ijs. Breng een vlieg per keer op een siliconen elastomeer dissectie plaat.OPMERKING: Bereid ontledingsplaten ten minste 1 week voor gebruik voor, bij het uitharden bij kamertemperatuur. Om dit te doen, bereid het elastomeer en giet het in een 33 mm x 10 mm petrischaal, het vullen van de schotel ongeveer halverwege. Tik voorzichtig op de schotel op een vlakke ondergrond om luchtbellen te minimaliseren. Laat de platen zitten op kamertemperatuur, ongestoord, voor ten minste een week. Onder een ontleden stereomicroscoop, oriënteren van de vlieg ventrale kant omhoog. Met behulp van insectenspelden, pin de vlieg op de plaat door het invoegen van een pin door de thorax en een andere pin door de meest achterste uiteinde van de buik, in de buurt van de genitaliën (Figuur 2A). Het kan nuttig zijn om de pinnen in tweeën te snijden voordat het monster wordt vastgemaakt om de dissectie niet te belemmeren. Herhaal dit met maximaal 10 vliegen per dissectieplaat.OPMERKING: Optioneel: Verwijder de vleugels en benen voordat u vlieg naar bord speldt. Dit zal helpen voorkomen dat een bel vormen rond de vlieg wanneer de media wordt toegevoegd. Zodra alle vliegen zijn vastgemaakt aan de plaat, voeg genoeg dissectie media om de vliegen (~ 1 mL) met behulp van een transfer pipet te dekken. Verwijder met behulp van tangen of cuticulaschaar het hoofd. Met behulp van cuticula schaar, maak twee horizontale insnijdingen: een direct boven de achterste pin in de buik, en een ander aan de meest voorste einde van de buik, waar de thorax en buik voldoen(Figuur 2B, C). In figuur 2werd het hoofd intact gelaten om de oriëntatie te verduidelijken. Maak een verticale incisie, het aansluiten van de twee horizontale insnijdingen (de drie sneden lijken op de letter I). Dit opent de buikholte(figuur 2D). Met behulp van tangen, verwijder de inwendige organen en weefsel, het vermijden van de dorsale vat. Als ongestoord, kan het transparante dorsale vat vaak worden gezien pulserende in de buurt van het voorste uiteinde van de buik. Extra pinnen kunnen worden gebruikt om nieuwe snijuiteinden van de cuticula(figuur 2E, F)open te pinnen. Verwijder met behulp van een schnitige schaar de thorax. Als alternatief kan de thorax worden verwijderd voordat de ontleede nagelriemen en het rugvat op een microscoopdia worden gemonteerd. Herhaal dit met de resterende vliegen.  ontleden vliegt tijdig, om mogelijke variaties in fagocytische snelheid te minimaliseren. Zodra alle vliegen zijn ontleed, laat de nagelriemen met de bijgevoegde rugvat vastgepind aan de plaat. Stap 5 wordt uitgevoerd in de dissectieplaat. Dit voorkomt beschadiging of per ongeluk weggooien van nagelriemen tussen de stappen. 5. Fixatie en kleuring Fix ontleed cuticles with attached dorsal vessel in 4% paraformaldehyde (PFA). Met behulp van een nieuwe wegwerp overdracht pipet voor elke stap, gooi de dissectie media, en vervangen door 1 mL van 4% PFA. Houd de dissecties zoveel mogelijk beschermd tegen licht tijdens de fixatie en kleuring. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met schommelen bij 20 rpm. Laat niet dissecties te zitten in fixatieve voor meer dan 20 minuten, omdat dit zou kunnen beginnen met het weefsel te beschadigen. Was nagelriemen 2x in 1x PBS + 0,1% Tween (PBST). Verwijder fixatief en vervang door 1 mL van 1x PBST. Was op kamertemperatuur gedurende 15 minuten met schommelen. Herhaal 1x.OPMERKING: Ontleed, vast weefsel kan worden opgeslagen bij 4 °C, voor maximaal 3 dagen, beschermd tegen licht, na de eerste wasbeurt door het vervangen van de was door verse PBST. Bewaar vast weefsel niet als er antilichamen worden gebruikt. Antilichamen moeten worden gebruikt met vers weefsel voor de beste resultaten. Optioneel: Antilichaam kleuring. Antilichamen kunnen worden gebruikt om het dorsale vat duidelijk te visualiseren(figuur 3),of om hemocyte specifieke markers te detecteren. Dit kan ervoor zorgen dat alleen cellen langs het dorsale vat worden geteld of om het membraan van de hemocyten te markeren. Verwijder de tweede was, voeg primaire antilichaam bij de juiste verdunning. Incubeer ‘s nachts bij 4 °C, met schommelen. Verwijder primaire antilichaam, en was twee keer met PBST gedurende 15 minuten met schommelen. Voeg fluorescerend secundair antilichaam toe. We raden een groen fluorescerend antilichaam aan, zodat het de fluorescerende deeltjes niet verduistert. Incubeer bij kamertemperatuur voor 2 h, met schommelen. Verwijder secundair antilichaam, was twee keer gedurende 15 minuten per stuk met PBST. Vlek met DAPI. Verwijder de laatste wasbeurt en vervang deze door 1 mL DAPI verdund in PBST (1:1000). Vlek voor 20 minuten met schommelen op kamertemperatuur. Verwijder DAPI en was 2x (herhaal stap 5.2). Vervang de laatste wasbeurt door verse 1x PBST.LET OP: Vliegen kunnen worden opgeslagen bij 4 °C, voor maximaal 3 dagen, beschermd tegen licht, na de eerste wasbeurt door het vervangen van de was door verse PBST. 6. Montage van nagelriemen op microscoopdia’s en beeldvorming Bereid ontleede nagelriemen. Onder de ontleden stereomicroscoop, afgesneden overtollige cuticula die kunnen interfereren met de beeldvorming. Breng met behulp van tangen de nagelriemen met bevestigd dorsale vat over in een 1,5 mL microcentrifugebuis met 70% glycerol. Het plaatsen van de nagelriemen in glycerol zal helpen verwijderen PBST en zorgt voor een duidelijker beeld tijdens de beeldvorming. Zet nagelriemen op de microscoopplaat. Voeg een paar druppels van 70% glycerol toe aan een microscoopplaat. Verwijder met behulp van tangen nagelriemen uit de glycerolbuis en plaats in glycerol op de glijbaan. Gebruik onder de ontledende stereomicroscoop tangen om nagelriemen naar boven te oriënteren, zodat het dorsale vat zichtbaar is. Het donkere pigment van de nagelriem zal naar beneden worden gezwenkeld. Voeg indien nodig een extra druppel glycerol toe. Dit helpt luchtbellen te voorkomen en zorgt voor een duidelijker beeld. Plaats voorzichtig een coverslip over nagelriemen en sluit randen af met nagellak. Laat 10-15 minuten drogen voordat u verdergaat. Beeld de vliegen onmiddellijk of bewaar in een lichtdichte doos bij 4 °C. Beeld het dorsale vat voor. Gebruik met behulp van een fluorescerende microscoop het structurele interferentiesysteem om optische delen van het dorsale vat te genereren. Een confocale microscoop kan als alternatief worden gebruikt die extra nauwkeurigheid kan bieden. Verkrijg Z-stack beelden van het dorsale vat met behulp van een 20x objectieve en voorkeur imaging software. Voeg een schaalbalk van 10 mm toe en label en sla afbeeldingen correct op als tiff-bestanden(figuur 4)of het gewenste formaat.OPMERKING: Het aantal verkregen Z-stack afbeeldingen kan variëren tussen ontlesecties en hangt af van hoe goed het dorsale vat is ontleed en van de gewenste stapgrootte tussen afbeeldingen. Hier werd de stapgrootte ingesteld op 0,49 mm. Dat aantal kan variëren van 3 tot 40 beelden per stapel in onze ervaring. 7. Afbeeldingen analyseren Kwantificeer fluorescerende gebeurtenissen met ImageJ. Open afbeeldingen en stapel ze op: Image à Stacks à Images to Stack. Tel alleen de ~ 1 mm grote fluorescerende signalen binnen een diameter van 10 mm gecentreerd op een DAPI-positieve kern door te klikken op elke gebeurtenis van ten minste 10 cellen per vlieg, van ten minste 10 vliegen per leeftijd per deeltje type geïnjecteerd: Plugins à Analyze à Cell Counter Notice ( Figuur5A). Het gereedschap Melding van de celteller wijst een andere kleur toe aan elke bijgehouden cel, met een gekleurde stip die overeenkomt met elke fluorescerende gebeurtenis waarop in die cel wordt geklikt. Als u de teller- en stapelpositie wilt weergeven die aan elk punt is gekoppeld, drukt u op ‘m’ of selecteert u Meten onder het tabblad Analyseren of drukt u op ‘alt +y'(figuur 5B)om het aantal gebeurtenissen weer te geven dat in elke cel wordt geteld in een resultatentabel. Breng de celtellingen over naar een spreadsheet die moet worden gebruikt voor statistische analyse. Statistische analyse uitvoeren. Analyseer verschillen in fagocytische gebeurtenissen met behulp van vaste effecten ANOVA of mixed-model geneste ANOVA. Gemengde modellen kunnen worden gebruikt om de belangrijkste vaste effecten van leeftijd en genotype en het willekeurige effect van individuen genesteld in elk genotype17te testen.OPMERKING: Onderzoekers moeten rigoureus zijn in het testen van de veronderstellingen van een statistische procedure die wordt gebruikt om de gegevens te analyseren.