Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması
Summary
GPCR’lerin cazip ilaçlanabilir hedefler olduğu göz önüne alındığında, GPCR ligand taraması böylece kurşun bileşiklerinin belirlenmesi ve yetimleşme çalışmaları için vazgeçilmezdir. Bu çalışmalara yönelik olarak, TEV tabanlı bir muhabir tsay’ı kullanarak yaklaşık 300 KPCR’de geçici β-arrestin2 alımının eşzamanlı olarak profilini çıkarmak için kullanılan açık kaynak kaynak platformu PRESTO-Tango’u tanımlıyoruz.
Abstract
Hücresel sinyal yollarının en büyük ve en çok yönlü gen superfamily ve arabulucuları olarak, G-protein-coupled reseptörleri (GPCR) ilaç endüstrisi için en umut verici hedeflerinden birini temsil eder. Ergo, gpcr ligand tarama testlerinin tasarımı, uygulanması ve optimizasyonu çok önemlidir, çünkü ilaç keşfi ve GPCR farmakolojisi ve sonuçlarını manipüle etmek için uzaktan kumanda araçlarını temsil etmektedirler. Geçmişte, G-protein bağımlı tahliller, ligand kaynaklı olayları tespit ve ikincil habercilerin nesil ölçme, araştırma bu alanda tiplenmiş. Ancak, fonksiyonel seçicilik gelişiyle, yanı sıra diğer birçok G protein-bağımsız yollar ve G-protein bağımlı tahliller ile ilişkili sınırlamalar artan bir farkındalık bu yana, alternatif oluşturulması yönünde daha büyük bir itme var GPCR ligand tarama tahlilleri. Bu çabaya doğru, böyle bir kaynağın uygulanmasını, PRESTO-Tango platformunun, insan GPCR-ome’nin paralel ve eşzamanlı sorgulamasını sağlayan, daha önce düşünülen bir başarıolan, teknik ve ekonomik açıdan mümkün değildir. G-protein bağımsız β-arrestin2 işe alım testini temel alan, GPCR’lerde β-arrestin2 aracılı insan ticaretinin ve sinyalizasyonunun evrenselliği, PRESTO-TANGO’yu yaklaşık 100’ü dahil olmak üzere yaklaşık 300 omalımsız insan KPCR’ı incelemek için uygun bir araç haline getirir. yetim reseptörleri. PRESTO-Tango’nun duyarlılığı ve sağlamlığı, bilinen ilaçlar için yeni GPCR hedeflerini ortaya çıkarmak veya yetim reseptörleri için yeni ligandlar keşfetmek için kullanılan bileşik kütüphaneleri kullanarak birincil yüksek iş yapma ekranları için uygun hale getirir.
Introduction
G-protein-coupled reseptörleri (GpPCR) transmembran proteinlerin en büyük ve en çeşitli aile oluşturmaktadır, bir hücre ve çevresi arasında iletişim arabirimleri olarak faaliyet1. GPCR çok yönlülük ligands çeşitli bir dizi tespit yeteneği ile vurgulanır-nörotransmitterlerden nükleotitler için, peptidler fotonlara, ve daha birçok-yanı sıra çok sayıda aşağı sinyal çağlayanlar hücresel büyüme, göç, farklılaşma, apoptosis, hücre ateş, vb2,3. Fizyolojik süreçlerin çok sayıda onların her yerde ve katılımı göz önüne alındığında, bu reseptör ailesi son derece terapötik öneme sahiptir, şu anda mevcut reçete li ilaçların üçte birinden fazla hedef GPCRs4gerçeği ile vitrine . Ancak, bu mevcut terapötikler sadece süper ailenin küçük bir alt kümesini hedeflemektedir (%10) ve birçok GPCR’nin farmakolojisi henüz aydınlatılmamıştır. Ayrıca, 100’den fazla PcPCR yetim reseptörleri olarak var, onlar endojen ligand5ile eşleşen olmamıştır gibi. Bu nedenle, GPCR ligand taraması deorphanization ve ilaç gelişiminde kritik, kurşun bulma ve optimizasyon yolunda yol açar gibi, ve muhtemelen klinik deneme aşamasına.
GPCR ligand tarama yöntemleri geleneksel olarak g-protein bağımlı veya G-protein bağımsız fonksiyonel tahliller6olmak üzere iki kategoriden birine düşmüştür. GPCR sinyalizasyonu heterotrimerik G proteinleri (Gαβγ) tarafından düzenlenir ve Gα alt birimi7’yebağlı GSYİh için GTP değişimi ile aktive edilir. Aktif reseptörden gelen sinyaller, cAMP, Kalsiyum, DAG ve IP3 gibi ikincil haberciler aracılığıyla G-proteinleri tarafından transeyoluyla downstream efektörleri8’deaşağı sinyalizasyona aracılık eder. G-protein sinyalinin fonksiyonel sonuçlarının doğası, reseptör aktivasyonunu yansıtan hücre bazlı tahliller oluşturmak için kullanılmıştır. G-protein sinyalizasyonunda proksimal (doğrudan) veya distal (dolaylı) olayları ölçen bu yöntemler en sık GPCR ligand taraması nda kullanılırve esas olarak deorphanization çalışmalarında 6. GPCR aracılı G-protein aktivasyonunu doğrudan ölçen tahlil örnekleri arasında [35S]GTPγS bağlayıcı tahlil, gα alt ünitesine radyoetiketli ve hidrolize edilemeyen GTP analogunun ve Förster/biyolüminesans rezonans enerji transferinin (FRET/BRET, sırasıyla) gpcr-Gα ve Gα/Gγ etkileşimlerini izlemek için 9,10yıliçinde daha fazla çekiş elde eden probların bağlanmasını ölçen. Distal olayları izlemek GPCR profilleme için en yaygın olarak kullanılan araçlar olduğunu tahliller; örneğin, cAMP ve IP1/3 tahlilleri G-proteinbağımlı ikincil habercilerin hücre içi birikimini ölçerken, [Ca2+] akı ve G-protein aktivasyonuna karışan spesifik yanıt öğelerini içeren muhabir tahlilleri (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) sinyalleri veren basamak11’indaha aşağısındaki olayları inceler. Söz konusu tahlillerin çoğu yüksek iş seviyesi düzeyinde gerçekleştirilebilse de, oldukça hassas, ve bazı tasmaya özgü avantajları övünme (örneğin, gtpγs bağlama durumunda tam / kısmi agonistler, nötr antagonistler ve ters agonistler arasında ayrımcılık, ya da [Ca2 +] ve IP1/3 gibi canlı hücrelerde gut işlevselliği)6, ne yazık ki tüm ilaç GPCR-ome sorgulama uygun mevcut G-protein bağımlı yöntemler vardır. Bu büyük ölçüde birden fazla G-protein alt ailelerin In GPCR yerli kaplin kaynaklanmaktadır, birkaç basamaklı ve yetim G-protein kaplin de bilinmeyen G-protein kaplin sinyal sonuçlanan. Bu sorunu azaltmak için, tahliller promiscuous G-protein kaplin cAMP gibi tek bir ortak sinyal okuma yoluyla zorlamak için geliştirilmiştir, ve Ca2 +, çoğu düşük iş gücü12olsa .
GPCR yaşam döngüsünün önemli bir yönü G-proteinbağımlı sinyalizasyon sona erdirilmesi, büyük ölçüde G-protein ayrıştırma neden β-arrestins işe yoluyla oluşur, ve sonuçta reseptör duyarsızlaştırma, hangi clathrin kaplı internalization için hedeflenen13. Β-arrestinin en yaygın olarak ifade edilen isoformları görsel olmayan β-arrestin1 ve β-arrestin2’dir, ayrıca sırasıyla arrestin-2 ve arrestin-3 olarak da belirtilir,sırasıyla 14. GPCR ligand taramasına yeni bir boyut katan G-protein bağımsız hücre bazlı tahliller girin; reseptör ticareti, etiketsiz tüm hücre ve β-arrestin işe alım tahlilleri dikkate değer örneklerdir. GPCR kaçakçılık tahlilleri reseptör15hedefleyen florofor etiketli ligands veya ko-internalize antikorlar istihdam ederken, etiketsiz tüm hücre tahlilleri ligand tarafından indüklenen hücresel değişiklikleri çevirmek biyosensörler kullanın ölçülebilir çıkışlar, elektrik veya optik sinyaller gibi16. Özellikle, quintessential GPCR- β-arrestin etkileşimleri, fonksiyonel tahlillerin repertoiresinde çekici bir araç olarak β-arrestin işe alım tahlillerini moda eder17. İlk olarak Barnea ve ark. tarafından sadece on yıl önce geliştirilen Tango sistemi, üç eksojen genetik elementin tanıtılmasını içerir: β-arrestin2’den oluşan bir protein füzyonu tütün etch virüs proteazı (TEVp), bir tetrasiklin transaktivator (tTA) tütün etch ile GPCR’ye bağlanır. virüs proteaz dekolte sitesi (TEVcs) ve V2 vazopressin reseptörünün C-terminus bir dizi öncesinde (V2 kuyruk) işe tutuklama teşvik etmek, ve transkripsiyon tarafından tetiklenen bir muhabir luciferase gen β-arrestin2 işe alımını takiben membran demirlemeden serbest bırakılan çekirdeğe tTA transkripsiyon faktörü translokasyonu (Şekil 1)18. GPCR aktivasyonu ve β-arrestin2 işe kantitatif okumalar daha sonra lüminesans için okuma ile belirlenebilir. Önemli bir ayrım reseptör ticareti ve etiketsiz tüm hücre yöntemleri nispeten düşük iş akışı iken, Tango çeşitli avantajları vardır, hedef reseptör ve sinyal entegrasyonu nedeniyle duyarlılık özgü seçici okuma dahil olmak üzere, hangi daha büyük bir ölçekte ligand tarama için uygun bir aday yapmak18.
Kroeze ve ark. bu stratejik özellikler göz önüne alındığında, PRESTO-Tango (Transkripsiyonel Çıktı-Tango ile Paralel Reseptör-ome İfade ve Tarama), paralel ve eşzamanlı bir şekilde ilaçlanabilir GPCR-ome profili tango yaklaşımını kullanan bir yüksek verim açık kaynak platformu19geliştirdi. Neredeyse tüm GPCR’lere β-arrestin2’nin “promiscuous” işe alımını kullanan PRESTO-Tango, hücre bazlı fonksiyonel tahliller açısından türünün ilk türünün ilk günüdür ve yetimler de dahil olmak üzere, G-protein alt familya bağlantısından bağımsız olarak küçük molekül bileşiklerinin hemen hemen tüm koku dışı KPCR’larda hızlı “ilk tur” taranmasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konformasyonel dinamik GPCR sinyal iletiminin güç merkezleridir. Bu heptahelical reseptörlerin bağlayıcı ceplerinin fizyokimyasal özellikleri ve fizyolojik önemi GPCR ligand tarama araçlarına duyulan ihtiyacın altını çizer. Yukarıda sunulduğu gibi, PRESTO-Tango testi hızlı, hassas ve kullanıcı dostudur ve kendini uyuşturucu gelişimine ödünç vetir. Sadece bu taht agonist kaynaklı aktivasyon ölçmek yok, ama aynı zamanda antagonistlerve allosteric modülatörlerin etkinliğini ölçmek için kul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR hibe #MOP142219) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2×3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
References
- Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).
- Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. G-protein-coupled receptors at a glance. Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).
- Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Ngo, T., et al. Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches. British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
- Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets. Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).
- Wettschureck, N., Offermanns, S. Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions. Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).
- Denis, C., Saulière, A., Galandrin, S., Sénard, J. -. M., Galés, C. Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands. Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).
- Yin, H., et al. Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay. The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).
- Cheng, Z., et al. Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways. Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).
- Roth, B. L., Kroeze, W. K. Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily. The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).
- Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. G Protein-Coupled Receptor Signaling Through β-Arrestin-Dependent Mechanisms. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The β-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).
- Böhme, I., Beck-Sickinger, A. G. Illuminating the life of GPCRs. Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).
- Fang, Y. Label-Free Receptor Assays. Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).
- Wang, T., et al. Measurement of β-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).
- Kroeze, W. K., et al. PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).
- Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).
- Walther, C., Ferguson, S. S. G. Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling. Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).
- Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation. Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).
- Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE. Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).
- Blau, H. M., Rossi, F. M. Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).
- Roche, O., et al. Development of a Virtual Screening Method for Identification of “Frequent Hitters” in Compound Libraries. Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).
