Параллельный допрос по набору в лигунд-2 для скрининга в Лиганде по шкале GPCR с использованием PRESTO-Tango Assay

G-белковые рецепторы (GPCRs) представляют собой самое большое и разнообразное семейство трансмембранных белков, работающих в качестве связующих интерфейсов между клеткой и ее окружающей средой^1. Универсальность GPCRs подчеркивается их способность обнаруживать разнообразный спектр лигандов от нейротрансмиттеров до нуклеотидов, пептидов до фотонов, и многое другое, а также их способность регулировать многочисленные вниз по течению сигнальных каскадов, участвующих в клеточном росте, миграции, дифференциации, апоптоза, стрельбы клеток и т.д.²,^3. Учитывая их повсеместность и участие во множестве физиологических процессов, это семейство рецепторов имеет первостепенное терапевтическое значение, продемонстрированное тем фактом, что более трети имеющихся в настоящее время предписанных лекарств нацелены на GPCRs^4. Тем не менее, эти существующие терапевтические только целевой небольшой подмножество суперсемьи (по оценкам, 10%), и фармакология многих GPCRs остается необезвеченной. Кроме того, более 100 GPCRs существуют как сиротские рецепторы, так как они не были сопоставлены с эндогенным^{лигандом 5}. Таким образом, скрининг GPCR ligand имеет решающее значение в дефанфанизации и разработке лекарств, поскольку он прокладывает путь к открытию и оптимизации свинца, и, возможно, к стадии клинических испытаний.

Методы скрининга GPCR ligand традиционно упали в одной из двух категорий, G-белковая зависимость или G-белок независимых функциональных анализов⁶. Сигнализация GPCR регулируется гетеротримыми G-белками (ГЗЗ), которые активируются в виде обмена GTP на ВВП, связанных на субъединице⁷. Сигналы от активированного рецептора передаются G-белками через вторичные посланники, такие как cAMP, Кальций, DAG и IP3, чтобы посредничать вниз по течению сигнализации на вниз по течению эффекторов⁸. Характер функциональных последствий G-белковой сигнализации был использован для создания клеточных анализов, которые отражают активацию рецепторов. Эти методы, которые измеряют проксимальные (прямые) или дистальные (косвенные) события в G-белковой сигнализации, наиболее часто используются для скрининга лиганд GPCR и в основном используются в исследованиях десиротенизации⁶. Примеры анализов, которые непосредственно измеряют активацию G-белка при посредничестве GPCR, включают в себя связывающую асссид «35S»GTP-S, которая измеряет связывание радиомаркированных и негидроизируемых аналогов GTP с субъединицей ГЗ, и Фюрстер/биолюминесценционный резонансный рецензионный перенос энергии (FRET/BRET, соответственно) зонды для мониторинга GPCR-G и ГЗ /ГЗ взаимодействий, которые набирают больше тяги на протяжении⁹лет^,10. Анализы, которые отслеживают дистальные события, являются наиболее часто используемыми инструментами для профилирования GPCR; например, анализы cAMP и IP1/3 измеряют внутриклеточное накопление G-белковых зависимых вторичных посланников, в то время как «Ca^2»– поток и репортирующие анализы, связанные с конкретными элементами реакции, вовлеченными в активацию G-белка (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), изучают события, далее вниз по течению сигнального каскада^11. В то время как большинство вышеупомянутых анализов могут быть выполнены на высоком уровне пропускной записи, являются довольно чувствительными, и похвастаться определенными ассаем-специфических преимуществ (например, дискриминация между полными / частичными агонистов, нейтральных антагонистов и обратных агонистов в случае связывания GTP, или анализ функциональности на живых клетках, таких как “Ca^2″и IP1/3)⁶, Есть, к сожалению, нет существующих G белково-зависимых методов быть подходящим допроса всего druggable GPCR.ru. Это в значительной степени связано с родной связи нескольких G-белковых подсемейств с GPCRs, в результате чего сигнализации на нескольких каскадах и неизвестных G-белков ойс на сиротах GPCRs. Чтобы смягчить эту проблему, анализы были разработаны, чтобы заставить беспорядочную G-белок связи через один общий сигнализации считывания, такие как cAMP, и Ca^{2 “,}хотя большинство из них имеют низкую пропускную силу¹².

Важным аспектом жизненного цикла GPCR является прекращение G-белково-зависимой сигнализации, которая происходит в значительной степени за счет набора q-arrestins, который вызывает диссоциацию G-белка, и в конечном итоге десенсибилизации рецептора, который предназначен для клатрин покрытием интернализации¹³. Наиболее повсеместно выраженными изоформами з-арестина являются невизуальные q-arrestin1 и q-arrestin2, также обозначенные как arrestin-2 и arrestin-3, соответственно¹⁴. Введите G-протеиновые независимые анализы на основе клеток, которые добавляют новое измерение скринингу лиганда GPCR; торговля рецепторами, без этикетки целые ячейки, и к-арестин вербовки анализы все примечательные примеры. GPCR торговли анализы использовать флюорофор помечены лиганды или совместно интернализированных антител, направленных на рецептор¹⁵, в то время как этикетка свободных целых клеток анализы использовать биосенсоры, которые переводят клеточные изменения, вызванные лиганд связывания в количественных выходов, таких как электрические или оптические сигналы¹⁶. Примечательно, что квинтэссенцией GPCR– – арестин взаимодействий моды на набор анализ q-arrestin как привлекательный инструмент в репертуаре функциональных анализов¹⁷. Система танго, впервые разработанная Барнеа и др. всего десять лет назад, включает в себя введение трех экзогенных генетических элементов: синтез белка, состоящий из q-arrestin2 с протеазой вируса табачного etch (TEVp), тетрациклинового трансактиватора (tTA), который привязан к GPCR через табак etch вирус протеаза расщепления сайта (TEVcs) и предшествует последовательность из C-терминус V2 вазопрессин рецептор (V2 хвост) для содействия арестин вербовки, и репортер luciferase гена, транскрипция которого вызвана tTA транскрипции фактор транскрипции транскрипции транслокации в ядро, которое освобождается от мембраны якорь после q-arrestin2 вербовки (Рисунок 1)¹⁸. Количественные показания активации GPCR и набора q-arrestin2 могут быть впоследствии определены путем чтения для люминесценции. Заметным отличием является то, что в то время как торговля рецепторами и этикетки свободных целых клеточных методов являются относительно низкой пропускной способом, танго имеет ряд преимуществ, в том числе селективного чтения, что характерно для целевого рецептора и чувствительность из-за интеграции сигнала, которые делают его подходящим кандидатом для лиганда скрининга в большей шкале¹⁸.

В связи с этими стратегическими особенностями, Kroeze et al. разработаны PRESTO-Tango (Параллельное выражение и скрининг рецепторов и скрининг атлетизм через транскрипционный выход-Танго), высокопроизводительная платформа с открытым исходным кодом, которая использует подход Tango для профиля наркотического GPCR-ome в параллельной и одновременной манере¹⁹. Используя «неразборчивый» набор q-arrestin2 почти для всех GPCRs, PRESTO-Tango является первым в своем роде с точки зрения функциональных анализов на основе клеток, что позволяет быстро “первый раунд” скрининга малых молекулных соединений почти на всех необонятельных GPCRs, в том числе сирот, независимо от G-белка подсемейства.