Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande e diversificata famiglia di proteine transmembrane, operando come interfacce di comunicazione tra una cellula e il suo ambiente¹. La versatilità dei GPR è evidenziata dalla loro capacità di rilevare una vasta gamma di ligandi – dai neurotrasmettitori ai nucleotidi, peptidi ai fotoni, e molti altri – così come la loro capacità di regolare numerose cascate di segnalazione a valle coinvolte nella crescita cellulare, migrazione, differenziazione, apoptosi, cottura cellulare, ecc^2,3. Considerando la loro ubiquità e il coinvolgimento in una moltitudine di processi fisiologici, questa famiglia di recettori è della massima importanza terapeutica, dimostrare dal fatto che più di un terzo dei farmaci prescritti attualmente disponibili si rivolgono a GPCR⁴. Tuttavia, queste terapie esistenti si rivolgono solo a un piccolo sottoinsieme della superfamiglia (circa il 10%) e la farmacologia di molti GPCR rimane non chiarita. Inoltre, più di 100 GP esistono come recettori orfani, in quanto non sono stati abbinati a un ligando endogeno⁵. Pertanto, lo screening dei ligandi GPCR è fondamentale per la deorfamentizzazione e lo sviluppo di farmaci, in quanto spiana la strada verso la scoperta e l’ottimizzazione dei condotti e, eventualmente, verso la fase di sperimentazione clinica.

I metodi per lo screening dei ligandi GPCR sono tradizionalmente rientrati in una delle due categorie, le analisi funzionali indipendenti dalla proteina G o dalla proteina G⁶. La segnalazione di GPCR è regolata da proteine G eterotrimerici (G , g , che vengono attivate dallo scambio di GTP con il PIL vincolato alla sottounità^{7 di}G . I segnali provenienti dal recettore attivato vengono trasdotti dalle proteine G tramite messaggeri secondari, come cAMP, Calcio, DAG e IP3, per mediare la segnalazione a valle agli effetti a valle⁸. La natura delle conseguenze funzionali della segnalazione delle proteine G è stata sfruttata per creare analisi basate sulle cellule che riflettono l’attivazione del recettore. Questi metodi, che misurano gli eventi prossimali (diretti) o distali (indiretti) nella segnalazione delle proteine G, sono più frequentemente utilizzati per lo screening dei ligandi GPCR e sono stati principalmente impiegati negli studi di deorfanotrizzazione⁶. Esempi di saggi che misurano direttamente l’attivazione delle proteine G mediate da GPCR includono il saggio vincolante [35S]GTP che misura il legame di un analogo GTP radioetichettato e non idrolizzabile alla sottounità di G, e il trasferimento di energia per la risonanza di F.risster/bioluminescenza (FRET/BRET, rispettivamente) sonde per monitorare le interazioni GPCR-G . I saggi che monitorano gli eventi distale sono gli strumenti più comunemente utilizzati per la profilazione GPCR; ad esempio, i saggi cAMP e IP1/3 misurano l’accumulo intracellulare di messaggeri secondari dipendenti dalla proteina G, mentre il flusso [Ca^2]e i saggi di reporter che coinvolgono elementi di risposta specifici implicati nell’attivazione della proteina G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) esaminano ulteriormente gli eventi a valle della cascata di segnalazione¹¹. Mentre la maggior parte dei suddetti saggi può essere eseguita a un livello di sono abbastanza sensibili, e vantano alcuni vantaggi specifici per l’analisi (ad esempio, la discriminazione tra agonisti completi/parziali, antagonisti neutri e agonisti inversi nel caso della rilegatura GTPS, o la funzionalità di analisi su cellule vive come [Ca^{2 ]}e IP1/3)⁶, purtroppo non ci sono metodi dipendenti g-proteina esistenti che si adattino all’interrogatorio dell’intero GPCR-ome farmacologico. Ciò è in gran parte dovuto all’accoppiamento nativo di più sottofamiglie di proteine G ai GPCR, con conseguente segnalazione in diverse cascate e l’accoppiamento sconosciuto delle proteine G agli ORfani GPCR. Per mitigare questo problema, sono stati sviluppati saggi per forzare l’accoppiamento promiscuo di proteine G attraverso un’unica lettura comune di segnalazione, come il cAMP, e Ca^2,anche se la maggior parte di essi sono a basso consumo¹².

Un aspetto importante del ciclo di vita del GPCR è la cessazione della segnalazione dipendente dalle proteine G, che si verifica in gran parte attraverso il reclutamento di arresti z che induce ladissociazione della proteina G, e infine desensibilizzare il recettore, che è mirato per l’internalizzazione rivestita di clatra1in13 . Le isoforme più onnipresentisamente espresse di z-arrestin sono le non visive z-arrestin1 e z-arrestin2, indicate rispettivamente come arrestin-2 e arrestin-3, rispettivamente¹⁴. Inserisci i saggi basati sulle cellule indipendenti della proteina G, che aggiungono una nuova dimensione allo screening dei ligandi GPCR; il traffico di recettori, l’intera cellula senza etichetta e i saggi di reclutamento di arresto z sono tutti esempi degni di nota. I saggi di traffico di GPCR utilizzano ligandi con etichetta fluoroforo o anticorpi co-internalizzati che colpiscono il recettore¹⁵, mentre i saggi interi cellulari privi di etichetta utilizzano biosensori che traducono i cambiamenti cellulari indotti dal legame del ligando in output quantificabili, come i segnali elettrici o ottici¹⁶. In particolare, le interazioni per eccellenza nel GPCR- Il sistema Tango, sviluppato per la prima volta da Barnea et al. solo dieci anni fa, comporta l’introduzione di tre elementi genetici esogeni: una fusione proteica costituita da z-arrestin2 con proteasi del virus dell’incisione del tabacco (TEVp), un transattivatore di tetraciclina (tTA) legato a un GPCR tramite un virus dell’incisione del tabacco (TEVp), un transattivatore di tetraciclina (tTA) legato a un GPCR tramite un virus dell’incisione del tabacco sito di scissione di scissione (TEVcs) ed è preceduta da una sequenza del capoluogo C del recettore V2pressin (coda V2) per promuovere il reclutamento di arrestate, e un gene reporter luciferasi la cui trascrizione è innescata dal TTA fattore di trascrizione traslocazione al nucleo, che viene liberato dall’ancoraggio della membrana in seguito al reclutamento di z-arrestin2 (Figura 1)¹⁸. Le letture quantitative dell’attivazione della GPCR e del reclutamento di z-arrestin2 possono essere successivamente determinate leggendo la luminescenza. Una notevole distinzione è che mentre il traffico di recettori e i metodi interi cellulari privi di etichette sono relativamente a bassa velocità effettiva, il Tango ha diversi vantaggi, tra cui la lettura selettiva che è specifica per il recettore bersaglio e la sensibilità a causa dell’integrazione del segnale, che lo rendono un candidato adatto per lo screening dei ligandi su scala più ampia¹⁸.

In considerazione di queste caratteristiche strategiche, Kroeze e altri hanno sviluppato PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), una piattaforma open source ad alta velocità che utilizza l’approccio Tango per profilare il GPCR-ome drogabile in modo parallelo e simultaneo¹⁹. Sfruttando il reclutamento “promiscuo” di z-arrestin2 in quasi tutti i GPR, PRESTO-Tango è il primo nel suo genere in termini di analisi funzionali basate sulle cellule, consentendo uno screening rapido “di primo round” di piccoli composti molecolari in quasi tutti i GPL non olfattivi, compresi gli orfani, indipendentedall’accoppiamento della sottofamiglia della proteina G.