استجواب مواز لـ α-Arrestin2 تجنيد لـ Ligand الفحص على نطاق GPCR على نطاق واسع باستخدام PRESTO-Tango assay
Summary
وبالنظر إلى أن الـ GPCRs أهداف جذابة قابلة للتخدير، فإن فحص GPCR ligand أمر لا غنى عنه لتحديد مركبات الرصاص ودراسات إزالة التيتم. نحو هذه الجهود، ونحن نصف PRESTO-Tango، منصة موارد مفتوحة المصدر تستخدم للتنميط المتزامن للتجنيد العابر في حوالي 300 GPCRs باستخدام تقييم مراسل TEV.
Abstract
باعتبارها أكبر وأكثر تنوعا الجينات superfamily والوسطاء من سلسلة من مسارات الإشارات الخلوية، G-البروتين مقرونة مستقبلات (GPCRs) تمثل واحدة من الأهداف الواعدة لصناعة الأدوية. Ergo ، وتصميم وتنفيذ وتحسين GPCR ligand فحص المقالات أمر بالغ الأهمية ، لأنها تمثل أدوات التحكم عن بعد لاكتشاف المخدرات والتلاعب الدوائية GPCR والنتائج. في الماضي ، كانت المقالات المعتمدة على البروتين G تجسد هذا المجال من البحث ، واكتشاف الأحداث الناجمة عن ligand وتحديد عدد الرسل الثانويين. ومع ذلك ، منذ ظهور الانتقائية الوظيفية ، فضلا عن زيادة الوعي بعدة مسارات أخرى G المستقلة عن البروتين والقيود المرتبطة بمقالات G-البروتين تعتمد ، هناك دفعة أكبر نحو خلق بديل GPCR ligand فحص المقالات. نحو هذا المسعى ، ونحن نصف تطبيق واحد من هذه الموارد ، ومنصة PRESTO – Tango ، وهو نظام قائم على مراسل luciferase التي تمكن من الاستجواب المتوازي والمتزامن للGPCR -ome الإنسان ، وهو إنجاز كان ينظر فيه سابقا من الناحية الفنية والاقتصادية غير مجدية. واستناداً إلى اختبار تجنيد مستقل من نوع G-protein-ed-arrestin2، فإن عالمية الاتجار ببوساطة α-arrestin2 والإشارة في GPCRs تجعل PRESTO-TANGO أداة ملائمة لدراسة ما يقرب من 300 من وحدات GPCRs البشرية غير الشمية، بما في ذلك ما يقرب من 100 مستقبلات اليتيم. حساسية PRESTO-Tango وقوتها تجعلها مناسبة للشاشات الأولية عالية الإنتاجية باستخدام المكتبات المركبة ، وتستخدم للكشف عن أهداف GPCR جديدة للأدوية المعروفة أو لاكتشاف ليغاند جديدة للمستقبلات اليتيمة.
Introduction
تشكل مستقبلات البروتين G-المقترنة (GPCRs) أكبر عائلة وأكثرها تنوعًا من البروتينات عبر الغشاء ، وتعمل كواجهات اتصال بين الخلية وبيئتها1. ويبرز براعة GPCRs من خلال قدرتها على الكشف عن مجموعة متنوعة من ligands – من الناقلات العصبية إلى النيوكليوتيدات ، والببتيدات إلى الفوتونز ، وغيرها الكثير ، فضلا عن قدرتها على تنظيم العديد من الشلالات إشارات المصب المشاركة في النمو الخلوي ، والهجرة ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج ، وإطلاق الخلايا ، وما إلى ذلك2،3. وبالنظر إلى انتشارها ومشاركتها في العديد من العمليات الفسيولوجية ، فإن هذه العائلة المستقبلة ذات أهمية علاجية قصوى ، ويتضح ذلك من خلال حقيقة أن أكثر من ثلث الأدوية الموصوفة المتاحة حاليًا تستهدف GPCRs4. ومع ذلك، تستهدف هذه العلاجات الموجودة فقط مجموعة فرعية صغيرة من الأسرة الخارقة (ما يقدر بـ 10٪)، ولا يزال علم الأدوية للعديد من وحدات المعالجة بالأدوية الوراثية غير مُستوضح. وعلاوة على ذلك، أكثر من 100 GPCRs موجودة كمستقبلات اليتيم، كما أنها لم تكن مطابقة مع ligand الذاتية5. وبالتالي ، فإن فحص GPCR ligand أمر بالغ الأهمية في إزالة التيتم وتطوير الدواء ، لأنه يمهد الطريق نحو اكتشاف الرصاص والتحسين ، وربما إلى مرحلة التجربة السريرية.
وقد انخفضت أساليب فحص جي بي سي جي ليغاند تقليديا في واحدة من فئتين، G-البروتين تعتمد أو G-البروتين مستقل مقالات وظيفية6. يتم تنظيم إشارات GPCR من قبل البروتينات G-البروتينات الغيرية (Gααα) ، والتي يتم تنشيطها من خلال تبادل GTP للناتج المحلي الإجمالي المقيد على الوحدة الفرعية Gα7. يتم نقل الإشارات من المستقبلات المنشطة بواسطة G-proteins عبر الرسل الثانوية ، مثل cAMP ، الكالسيوم ، DAG ، و IP3 ، للتوسط في إشارات المصب في المؤثرات المصب8. وقد استغلت طبيعة العواقب الوظيفية للإشارة G-البروتين لإنشاء الخلايا القائمة على المقالات التي تعكس تنشيط مستقبلات. هذه الأساليب، التي تقيس الأحداث القريبة (المباشرة) أو البعيدة (غير المباشرة) في إشارات G-protein، تستخدم في أغلب الأحيان لفحص GPCR ligand وقد استخدمت بشكل رئيسي في دراسات إزالة التيتم6. أمثلة على الاختبارات التي تقيس مباشرة GPCR بوساطة تنشيط G-البروتين تشمل [35S] GTPаS ملزمة للتحليل، الذي يقيس ملزمة من التسمية الإشعاعية وغير hydrolyzable GTP التناظرية إلى الوحدة الفرعية Gα، وFörster / bioluminescence نقل الطاقة بالرنين (FRET / بريت، على التوالي) تحقيقات لرصد GPCR-Gα وGα / Gα التفاعلات، والتي تم كسب المزيد من الجر على مدى السنوات9،10. المقالات التي ترصد الأحداث البعيدة هي الأدوات الأكثر استخدامًا لتنميط GPCR؛ على سبيل المثال، يقيس cAMP وIP1/3 التراكم داخل الخلايا للرسل الثانويين المعتمدين على G-protein، في حين أن [Ca2+]التدفق ومقالات المراسل ة التي تنطوي على عناصر استجابة محددة متورطة في تنشيط G-protein (CRE، NFAT-RE، SRE، SRF-RE) تفحص الأحداث بشكل أكبر في اتجاه التعاقب الالإشارات11. في حين أن معظم المقالات المذكورة أعلاه يمكن أن يتم إجراؤها على مستوى الإنتاجية العالية، حساسة إلى حد ما ، وتتباهى ببعض المزايا الخاصة بالقياس (على سبيل المثال ، التمييز بين الناهضات الكاملة / الجزئية ، والخصوم المحايدين والمناهضين العكسيين في حالة ربط GTPаS ، أو وظيفة القياس على الخلايا الحية مثل [Ca2 +] و IP1/3)6، للأسف لا توجد طرق تعتمد على البروتين G تناسب استجواب GPCR-ome القابل للتخدير بالكامل. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى اقتران الأصلي من الأسر الفرعية G-البروتين متعددة إلى GPCRs، مما أدى إلى إشارات في العديد من السلاسل التعاقبية واقتران البروتين G غير معروف في GPCRs اليتيم. للتخفيف من هذه المسألة، وقد وضعت المقالات لفرض مشوش G-البروتين اقتران من خلال إشارة واحدة مشتركة القراءة، مثل cAMP، وكاليفورنيا2 +، وإن كان معظمهم من الإنتاجية المنخفضة12.
أحد الجوانب الهامة في دورة حياة GPCR هو إنهاء الإشارات المعتمدة على البروتين G ، والتي تحدث في جزء كبير منها من خلال تجنيد α-arrestins الذي يؤدي إلى تفكك بروتين G ، وفي نهاية المطاف إزالة الحساسية من المستقبل ، والتي تستهدف الاستيعاب الداخلي المغلف بالكلاترين13. الأشكال المتساوية الأكثر تعبيراً في كل مكان من α-arrestin هي α-arrestin1 و α-arrestin2 غير البصرية، المشار إليها أيضاً باسم arrestin-2 وarrestin-3، على التوالي14. أدخل G-البروتين المستقلة الخلايا القائمة على المقالات, التي تضيف بعدا جديدا لفحص LIGAND GPCR; مستقبلات الاتجار، خلية كاملة خالية من التسمية، ومقال التوظيف α-arrestin كلها أمثلة بارزة. اختبارات الاتجار GPCR تستخدم الليغاند المسمى الفلوروفورأو الأجسام المضادة المشتركة التي تستهدفالمستقبلات 15، في حين تستخدم اختبارات الخلايا الكاملة الخالية من التسمية أجهزة الاستشعار الحيوية التي تترجم التغيرات الخلوية الناجمة عن الربط بالليجة إلى مخرجات قابلة للقياس الكمي ، مثل الإشارات الكهربائية أو البصرية16. وتجدر الإشارة إلى أن تفاعلات GPCR-α-arrestin الجوهرية تُعنى بعملية اختبار التوظيف باعتبارها أداة جذابة في ذخيرة المقالات الجوهرية17. نظام التانغو، الذي طوره بارينا وآخرون قبل عقد واحد فقط، ينطوي على إدخال ثلاثة عناصر وراثية خارجية: مزيج البروتين يتكون من α-arrestin2 مع بروتياز فيروس حفر التبغ (TEVp)، وهو محول التتراسيكلين (tTA) الذي يرتبط GPCR عن طريق فيروس حفر التبغ موقع انشقاق البروتياز (TEVcs) ويسبقه تسلسل من C-terminus من مستقبلات V2 فاسوبريسين (V2 الذيل) لتعزيز تجنيد arrestin، وجين لوسيفيراز المراسل الذي يتم تشغيل النسخ من قبل tTA نسخ عامل نقل إلى نواة، والتي يتم تحريرها من رسو الغشاء بعد تجنيد α-arrestin2(الشكل 1)18. ويمكن بعد ذلك تحديد القراءات الكمية لتفعيل GPCR وتجنيد α-arrestin2 من خلال القراءة للتلأل. وثمة تمييز ملحوظ هو أنه في حين أن الاتجار بالمستقبلات وطرق الخلايا الكاملة الخالية من التسمية منخفضة الإنتاجية نسبيًا ، فإن التانغو له العديد من المزايا ، بما في ذلك القراءة الانتقائية الخاصة بالمستقبل المستهدف والحساسية بسبب تكامل الإشارة ، مما يجعله مرشحًا مناسبًا لفحص ligand على نطاق أوسع18.
في ضوء هذه الميزات الاستراتيجية ، طورت Kroeze وآخرون PRESTO-Tango (التعبير المتوازي للمستقبلات -ome والفرز عبر النسخ الإخراج -Tango) ، وهي منصة مفتوحة المصدر عالية الإنتاجية تستخدم نهج Tango لتوصيف GPCR-ome القابل للتخدير بطريقة متوازية ومتزامنة19. استغلال “مشوش” تجنيد α-arrestin2 إلى ما يقرب من جميع GPCRs، PRESTO-Tango هو الأول من نوعه من حيث الاختبارات الوظيفية القائمة على الخلية، مما يتيح الفحص السريع “الجولة الأولى” من مركبات الجزيئات الصغيرة في جميع GPCRs تقريبا غير الشمية، بما في ذلك الأيتام، مستقلة عن اقتران الأسرة الفرعية G-البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
وGPCRs ديناميكية تشكيلية هي القوى من نقل الإشارات. الخصائص الفيزيوكيميائية للجيوب الملزمة لهذه المستقبلات heptahelical، فضلا عن أهميتها الفسيولوجية تؤكد الحاجة إلى أدوات فحص جي بي سي آر ليغاند. وكما هو موضح أعلاه، فإن اختبار PRESTO-Tango سريع وحساس وسهل الاستخدام، ويضفي نفسه على تطوير المخدرات. ليس فق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR منحة #MOP142219).
Materials
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2×3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
References
- Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).
- Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. G-protein-coupled receptors at a glance. Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).
- Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Ngo, T., et al. Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches. British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
- Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets. Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).
- Wettschureck, N., Offermanns, S. Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions. Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).
- Denis, C., Saulière, A., Galandrin, S., Sénard, J. -. M., Galés, C. Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands. Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).
- Yin, H., et al. Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay. The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).
- Cheng, Z., et al. Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways. Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).
- Roth, B. L., Kroeze, W. K. Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily. The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).
- Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. G Protein-Coupled Receptor Signaling Through β-Arrestin-Dependent Mechanisms. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The β-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).
- Böhme, I., Beck-Sickinger, A. G. Illuminating the life of GPCRs. Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).
- Fang, Y. Label-Free Receptor Assays. Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).
- Wang, T., et al. Measurement of β-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).
- Kroeze, W. K., et al. PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).
- Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).
- Walther, C., Ferguson, S. S. G. Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling. Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).
- Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation. Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).
- Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE. Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).
- Blau, H. M., Rossi, F. M. Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).
- Roche, O., et al. Development of a Virtual Screening Method for Identification of “Frequent Hitters” in Compound Libraries. Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).
