使用 PRESTO-Tango Assay 在 GPCR-宽范围范围内对 β-Arrestin2 进行配制筛查的平行审讯

G-蛋白质耦合受体（GPCRs）是最大、最多样化的跨膜蛋白系列，作为细胞与环境之间的通信接口^运行。GPCR 的多功能性因它们能够检测各种配体（从神经递质到核苷酸、肽到光子等）的能力，以及它们调节大量涉及细胞生长、迁移、分化、凋亡、细胞激发等的下游信号级联^的能力。考虑到它们无处不在和参与多种生理过程，这种受体家族具有最重要的治疗意义，目前超过三分之一的处方药针对GPCRs^4。然而，这些现有的治疗只针对一小部分的超级家族（估计10%），和许多GPCR的药理学仍然未被阐明。此外，100多个GPCRs作为孤儿受体存在，因为它们没有与内源配体⁵相匹配。因此，GPCR配体筛选在脱化和药物开发中至关重要，因为它为铅发现和优化铺平了道路，并可能进入临床试验阶段。

GPCR配体筛选方法传统上属于两类之一，即G蛋白依赖或G蛋白独立功能测定^6。GPCR 信号由异质 G-蛋白质 （G+） 调节，通过将 GTP 交换到 G# 子单元⁷上的 GDP 激活。来自激活受体的信号由G蛋白通过二次信使（如cAMP、钙、DAG和IP3）传递，以调解下游效应器⁸的下游信号。G蛋白信号的功能后果的性质已被利用来创建反映受体活化的基于细胞的检测。这些方法测量G蛋白信号中的近端（直接）或远端（间接）事件，最常用于GPCR配体筛选，主要用于脱化研究^6。直接测量GPCR介导G蛋白活化的测定示例包括 [35S]GTP_S 结合测定， 测量与G+子单元模拟的放射性标记和非水解GTP的绑定，以及Fürster/生物发光共振能量转移（分别为FRET/BRET）探测器，以监测GPCR-G+和G+/G®相互作用，这些相互作用在^9、10年间获得了更大的牵引力。分析监视器远端事件是 GPCR 分析最常用的工具;例如，cAMP和IP1/3测定测量G蛋白依赖性辅助信使的细胞内积累，而[Ca^2]通量和报告器检测涉及与G蛋白活化相关的特定响应元素（CRE、NFAT-RE、SRE、SRF-RE）检查信号级联¹¹下游事件。虽然上述大多数检测都可以在高吞吐量级别执行， 是相当敏感的，并夸耀某些测定特异性的优点（例如，在GTP_S结合的情况下，全/偏激动剂、中性拮抗剂和反向激动剂之间的歧视，或对活细胞（如[Ca^2]和IP1/3）6的检测功能，不幸的是，没有现有的G蛋白依赖方法适合对整个可摄药GPCR-ome的询问。这主要是由于多个G蛋白子家族与GPCR的本机耦合，导致多个级联的信号和孤儿GPCR未知G蛋白耦合。为了缓解此问题，已开发出一种测定方法，通过单个通用信令读出（如 cAMP 和 Ca^2+）强制混合 G 蛋白耦合，尽管大多数是低通量¹²。

GPCR生命周期的一个重要方面是G-蛋白依赖性信号的终止，这在很大程度上是通过招募β-逮捕素，导致G蛋白分离，并最终使受体脱敏，这是针对克拉林涂层内化^13。最普遍表达的β-逮捕形式是非视觉β-逮捕1和β-逮捕2，也分别表示为逮捕-2和逮捕-3，分别为^14。输入G蛋白独立细胞基测定，为GPCR配体筛选增加新的维度;受体贩运、无标签全细胞和β-逮捕招募检测都是值得注意的例子。GPCR贩运测定使用氟磷标记配体或联合内化抗体针对受体^15，而无标签全细胞检测使用生物传感器，将配体结合引起的细胞变化转化为可量化输出，如电信或光学信号^16。值得注意的是，典型的GPCR-β-逮捕互动时尚β-逮捕在招聘检测作为一个有吸引力的工具，在功能测定的剧目^17。探戈系统，最初由巴内亚等人开发，直到十年前， 涉及引入三种外源遗传元素：由β-卡丁2与烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEVp）组成的蛋白质融合，一种通过烟草蚀刻与GPCR相连的四环素转导剂（tTA）。 病毒蛋白酶裂解部位（TEVcs），前面是V2血管加压素受体（V2尾部）的C端序，以促进逮捕招募，和记者卢卡皮基因的转录是由tTA 转录因子转移到核，在β-逮捕2招募后从膜锚定中释放出来（图1）¹⁸。GPCR 激活和 β-逮捕2 招聘的定量读数随后可以通过读数来确定为发光。一个值得注意的区别是，虽然受体贩运和无标签全细胞方法的通量相对较低，探戈有几个优点，包括选择性读出是特定于目标受体和灵敏度由于信号集成，这使得它适合选择配体筛选在更大规模^18。

鉴于这些战略特征，Kroeze等人开发了PRESTO-Tango（通过转录输出探戈进行平行受体-渗透表达和筛选），这是一个高通量开源平台，使用探戈方法以并行和^{同时的方式对}可的药物GPCR-ome进行剖面分析。PRESTO-Tango 利用”混杂性”招募 β-逮捕2到几乎所有 GPCRs，在基于细胞的功能测定方面是首创的，几乎可以在所有非嗅觉性 GPCRs（包括孤儿）中快速”第一轮”筛选小分子化合物，而与 G-蛋白子家族耦合无关。