Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte und vielfältigste Familie von Transmembranproteinen, die als Kommunikationsschnittstellen zwischen einer Zelle und ihrer^Umgebung1 funktionieren. Die Vielseitigkeit von GPCRs wird durch ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Liganden zu erkennen – von Neurotransmittern bis zu Nukleotiden, Peptide bis hin zu Photonen und vielem mehr – sowie ihre Fähigkeit, zahlreiche nachgeschaltete Signalkaskaden zu regulieren, die an Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Apoptose, Zellabschuss^usw.beteiligt sind, sowie ihre Fähigkeit, zahlreiche nachgeschaltete Signalkaskaden zu regulieren, die an Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Apoptose, Zellabschuss usw. beteiligt sind,^werden. Angesichts ihrer Allgegenwart und Beteiligung an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen ist diese Rezeptorfamilie von größter therapeutischer Bedeutung, was durch die Tatsache belegt wird, dass mehr als ein Drittel der derzeit verfügbaren verordneten Medikamente auf GPCRs⁴abzielen. Diese bestehenden Therapeutika zielen jedoch nur auf eine kleine Teilmenge der Überfamilie ab (schätzungsweise 10 %), und die Pharmakologie vieler GPCRs bleibt ungeklärt. Darüber hinaus existieren mehr als 100 GPCRs als Orphan-Rezeptoren, da sie nicht mit einem endogenen Ligand⁵abgeglichen wurden. Daher ist das GPCR-Ligand-Screening entscheidend für die Entwaistisierung und Arzneimittelentwicklung, da es den Weg zur Lead-Entdeckung und -Optimierung und möglicherweise zur klinischen Testphase ebnet.

Methoden für das GPCR-Ligand-Screening sind traditionell in eine von zwei Kategorien gefallen, G-Protein-abhängige oder G-Protein-unabhängige funktionelle Assays⁶. Die GPCR-Signalisierung wird durch heterotrimere G-Proteine (G- und -Proteine) reguliert, die durch den Austausch von GTP gegen BIP aktiviert werden, die an die Untereinheit⁷gebunden sind. Signale des aktivierten Rezeptors werden von G-Proteinen über sekundäre Botenstoffe wie cAMP, Calcium, DAG und IP3 transduziert, um nachgeschaltete Signalisierung an downstreameffekten⁸zu vermitteln. Die Art der funktionellen Folgen der G-Protein-Signalisierung wurde genutzt, um zellbasierte Assays zu erstellen, die die Rezeptoraktivierung reflektieren. Diese Methoden, die proximale (direkte) oder distale (indirekte) Ereignisse in der G-Protein-Signalisierung messen, werden am häufigsten für das GPCR-Liganden-Screening verwendet und wurden hauptsächlich in Deorphanisierungsstudien eingesetzt⁶. Beispiele für Assays, die die GPCR-vermittelte G-Protein-Aktivierung direkt messen, sind der [35S]GTP-Bindungstest, der die Bindung eines radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren GTP analog zur G-Untereinheit misst, und Förster/Biolumineszenz-Resonanzenergieübertragung (FRET/BRET) zur Überwachung von GPCR-G- und G-/G-Wechselwirkungen, die in den Jahren⁹,¹⁰, an Zugkraft gewonnen haben. Assays, die distale Ereignisse überwachen, sind die am häufigsten verwendeten Tools für die GPCR-Profilerstellung; Z. B. messen cAMP- und IP1/3-Assays die intrazelluläre Akkumulation von G-proteinabhängigen Sekundärbotenstoffen, während [Ca²⁺] Fluss- und Reporter-Assays mit spezifischen Reaktionselementen, die an der G-Protein-Aktivierung beteiligt sind (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), Ereignisse weiter nach der Signalkaskade¹¹untersuchen. Während die meisten der oben genannten Assays auf einem hohen Durchsatzniveau durchgeführt werden können, sind ziemlich empfindlich und rühmen sich bestimmter assayspezifischer Vorteile (z.B. Diskriminierung zwischen Voll-/Teilagonisten, neutralen Antagonisten und inversen Agonisten im Falle der GTP-Bindung oder Assay-Funktionalität auf lebenden Zellen wie [Ca²⁺] und IP1/3)⁶, es gibt leider keine vorhandenen G-Protein-abhängigen Methoden, die der Abfrage des gesamten medikamentösen GPCR-Ome sausen. Dies ist weitgehend auf die native Kopplung mehrerer G-Protein-Unterfamilien mit GPCRs zurückzuführen, was zu Signalisierungen an mehreren Kaskaden und der unbekannten G-Protein-Kopplung bei verwaisten GPCRs führt. Um dieses Problem zu mildern, wurden Assays entwickelt, um die promiscuous G-Protein-Kopplung durch eine einzige gemeinsame Signalisierungsauslesung wie cAMP und Ca²⁺zu erzwingen, obwohl die meisten von ihnen einen niedrigen Durchsatz¹²sind.

Ein wichtiger Aspekt des GPCR-Lebenszyklus ist die Beendigung der G-Protein-abhängigen Signalisierung, die zu einem großen Teil durch die Rekrutierung von S-Arrestinen erfolgt, die eine Dissoziation des G-Proteins induziert und letztlich den Rezeptor desensizipiert, das für die clathrinbeschichtete Internalisierung¹³bestimmt ist. Die allgegenwärtigsten Isoformen von ‘-arrestin sind die nicht-visuellen ‘-arrestin1 und ‘-arrestin2, auch als arrestin-2 und arrestin-3 bzw.¹⁴bezeichnet. Geben Sie G-Protein-unabhängige zellbasierte Assays ein, die dem GPCR-Liganden-Screening eine neue Dimension verleihen; Rezeptorenhandel, etikettenfreie ganze Zelle und Rekrutierungs-Assays sind bemerkenswerte Beispiele. GPCR-Handelstests verwenden fluorophormarkierte Liganden oder ko-internalisierte Antikörper, die auf den Rezeptor^{abzielen 15}, während etikettenfreie Ganzzell-Assays Biosensoren verwenden, die zelluläre Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, in quantifizierbare Ausgänge wie elektrische oder optische Signale¹⁶übersetzen. Bemerkenswert ist, dass die Quintessenz der GPCR—Arrestin-Interaktionen den Rekrutierungs-Assay von ‘-arrestin als attraktives Werkzeug im Repertoire der funktionalen Assays¹⁷. Das Tango-System, das erst vor einem Jahrzehnt von Barnea et al. entwickelt wurde, beinhaltet die Einführung von drei exogenen genetischen Elementen: eine Proteinfusion, bestehend aus dem “-arrestin2” mit einem Tabak-Ätzvirus-Protease (TEVp), einem Tetracyclin-Transaktivator (tTA), der über ein Tabak-Etch-Virus an einen GPCR gebunden ist Protease-Spaltungsstelle (TEVcs) und wird von einer Sequenz aus dem C-Terminus des V2-Vasopressinrezeptors (V2-Schwanz) zur Förderung der Verhaftung bei der Rekrutierung und einem Reporter-Luziferase-Gen, dessen Transkription durch die tTA-Transkriptionsfaktor-Translokation in den Kern, der nach der Rekrutierung von A-arrestin2 aus der Membranverankerung befreit wird (Abbildung 1)¹⁸. Quantitative Messwerte der GPCR-Aktivierung und der Rekrutierung von ‘-arrestin2 können anschließend durch Lesen auf Lumineszenz bestimmt werden. Ein bemerkenswerter Unterschied ist, dass der Tango zwar den Rezeptorhandel und die etikettenfreien Ganzzellmethoden relativ gering ist, aber mehrere Vorteile hat, einschließlich des selektiven Auslesens, das spezifisch für den Zielrezeptor ist, und der Empfindlichkeit aufgrund der Signalintegration, die ihn zu einem geeigneten Kandidaten für das Liganden-Screening in größerem Maßstab^{machen 18}.

Angesichts dieser strategischen Merkmale entwickelten Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), eine Open-Source-Plattform mit hohem Durchsatz, die den Tango-Ansatz nutzt, um das medikamentöse GPCR-Ome parallel und gleichzeitig zu profilieren¹⁹. PRESTO-Tango nutzt die “promiscuous” Rekrutierung von ‘-arrestin2 für fast alle GPCRs und ist die erste seiner Art in Bezug auf zellbasierte funktionelle Assays, die ein schnelles “Erstrunden”-Screening von kleinen Molekülverbindungen an fast allen nicht-olfaktorischen GPCRs, einschließlich Waisen, unabhängig von der G-Protein-Unterfamilie ermöglicht.