Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior e mais diversificada família de proteínas transmembranas, operando como interfaces de comunicação entre uma célula e seu ambiente¹. A versatilidade dos GPCRs é destacada por sua capacidade de detectar uma variedade diversificada de ligantes – de neurotransmissores a nucleotídeos, peptídeos a fótons, e muito mais – bem como sua capacidade de regular numerosas cascatas de sinalização a jusante envolvidas no crescimento celular, migração, diferenciação, apoptose, disparo celular, etc.^2,3. Considerando sua ubiquidade e envolvimento em uma infinidade de processos fisiológicos, essa família receptora é de extrema importância terapêutica, demonstrada pelo fato de que mais de um terço dos medicamentos prescritos atualmente disponíveis têm como alvo as RPCRs⁴. No entanto, essas terapêuticas existentes visam apenas um pequeno subconjunto da superfamília (estimado em 10%), e a farmacologia de muitos GPCRs permanece inelucidada. Além disso, existem mais de 100 GPCRs como receptores órfãos, pois não foram combinados com um ligante endógeno⁵. Assim, a triagem de ligantes gpcr é fundamental na desordeirização e desenvolvimento de medicamentos, pois pavimenta o caminho para a descoberta e otimização de chumbo, e possivelmente para a fase de ensaio clínico.

Os métodos de triagem de ligantes GPCR tradicionalmente caíram em uma das duas categorias, ensaios funcionais independentes de proteína G ou g-proteína⁶. A sinalização GPCR é regulada por proteínas G heterotriméricas (Gαβγ), que são ativadas pela troca de GTP por PIB vinculado à subunidade Gα⁷. Os sinais do receptor ativado são transprovocados por proteínas G através de mensageiros secundários, como cAMP, Cálcio, DAG e IP3, para mediar a sinalização a jusante em efeitos a jusante⁸. A natureza das consequências funcionais da sinalização da proteína G tem sido explorada para criar ensaios baseados em células que refletem a ativação do receptor. Esses métodos, que medem eventos proximais (diretos) ou distais (indiretos) na sinalização de proteína G, são mais utilizados para a triagem de ligantes GPCR e têm sido empregados principalmente em estudos de desordeiro⁶. Exemplos de ensaios que medem diretamente a ativação de proteína G mediada pelo GPCR incluem o ensaio de ligação [35S]GTPγS, que mede a vinculação de um GTP radiorotulado e não hidrolisavel análogo à subunidade Gα, e sondas de transferência de energia de ressonância förster/bioluminescência (FRET/BRET, respectivamente) para monitorar as interações GPCR-Gα e Gα/Gγ, que vêm ganhando mais tração ao longo dos anos^9,10. Ensaios que monitoram eventos distais são as ferramentas mais utilizadas para a criação de perfis de GPCR; por exemplo, os ensaios cAMP e IP1/3 medem o acúmulo intracelular de mensageiros secundários dependentes da proteína G, enquanto os ensaios de fluxo e repórter [Ca^2+]envolvendo elementos de resposta específicos implicados na ativação da proteína G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) examinam eventos mais a jusante da cascata de sinalização¹¹. Embora a maioria dos ensaios acima mencionados possa ser realizada em um nível de alta duração, são bastante sensíveis, e possuem certas vantagens específicas do ensaio (por exemplo, discriminação entre agonistas completos/parciais, antagonistas neutros e agonistas inversos no caso da ligação GTPγS, ou funcionalidade de ensaio em células vivas como [Ca²⁺] e IP1/3)⁶, infelizmente não existem métodos dependentes de proteína G condizentes com o interrogatório de todo o GPCR-ome drogado. Isso se deve em grande parte ao acoplamento nativo de múltiplas subfamílias de proteína G aos GPCRs, resultando em sinalização em várias cascatas e o acoplamento desconhecido de proteína G em GPCRs órfãos. Para mitigar esse problema, foram desenvolvidos ensaios para forçar o acoplamento promíscuo de proteína G através de uma única leitura de sinalização comum, como cAMP, e Ca^2+,embora a maioria deles seja de baixa produção¹².

Um aspecto importante do ciclo de vida do GPCR é o término da sinalização dependente da proteína G, que ocorre em grande parte através do recrutamento de β-arrestins que induz a dissociação da proteína G, e, em última análise, dessensibilização do receptor, que é direcionado para a internalização revestida de clatina¹³. As isoformas mais expressas de β-arrestin são as β-arrestin1 e β-arrestin2 não-visuais, também denotadas como prisões em-2 e prisões em-3, respectivamente¹⁴. Insira ensaios baseados em células independentes de proteína G, que adicionam uma nova dimensão à triagem de ligantes GPCR; tráfico de receptores, célula inteira sem rótulos e β-arrestem em ensaios de recrutamento são todos exemplos notáveis. Os ensaios de tráfico do GPCR empregam ligantes rotulados com fluoroforo ou anticorpos co-internalizados direcionados ao receptor¹⁵, enquanto os ensaios celulares inteiros sem rótulos usam biosensores que traduzem alterações celulares induzidas por ligantes em saídas quantificáveis, como sinais elétricos ou ópticos¹⁶. Notavelmente, o quintessencial GPCR-β-arrestin interações forma o β-arrestin recrutamento como uma ferramenta atraente no repertório de ensaios funcionais¹⁷. O sistema Tango, desenvolvido pela primeira vez por Barnea et al. apenas uma década atrás, envolve a introdução de três elementos genéticos exógenos: uma fusão de proteínas constituída por β-arrestin2 com um vírus etch protease (TEVp), um transativador tetraciclina (TTA) que é amarrado a um GPCR através de um tabaco e tch vírus protease site (TEVcs) e é precedido por uma seqüência do C-terminus do receptor de vasopressina V2 (cauda V2) para promover a prisão no recrutamento, e um gene de luciferase repórter cuja transcrição é desencadeada pelo translocação do fator de transcrição tTA para o núcleo, que é libertado da ancoragem da membrana após β-arrestin2 recrutamento (Figura 1)¹⁸. Leituras quantitativas de ativação do GPCR e recrutamento β-arrestin2 podem ser posteriormente determinadas pela leitura para luminescência. Uma distinção notável é que, embora o tráfico de receptores e os métodos celulares inteiros sem rótulos sejam relativamente baixos, o Tango tem várias vantagens, incluindo leitura seletiva específica do receptor alvo e sensibilidade devido à integração de sinais, o que o torna um candidato adequado para a triagem de ligantes em uma escala maior¹⁸.

Em vista dessas características estratégicas, Kroeze et al. desenvolveram presto-tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), uma plataforma de código aberto de alto throughput que usa a abordagem Tango para traçar o perfil do GPCR-ome drogado de forma paralela e simultânea¹⁹. Explorando o recrutamento “promíscuo” de β-arrestin2 para quase todos os GPCRs, presto-tango é o primeiro de seu tipo em termos de ensaios funcionais baseados em células, permitindo uma rápida triagem “primeira rodada” de pequenos compostos de moléculas em quase todos os GPCRs não olfativos, incluindo órfãos, independente do acoplamento subfamiliar de proteína G.