Interrogation parallèle du recrutement d'2-Arrestin2 pour le dépistage de Ligand sur une échelle GPCR-Wide utilisant PRESTO-Tango Assay

Les récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) constituent la famille la plus importante et la plus diversifiée de protéines transmémbranées, fonctionnant comme interfaces de communication entre une cellule et son environnement¹. La polyvalence des GPCRs est mise en évidence par leur capacité à détecter un large éventail de ligands, des neurotransmetteurs aux nucléotides, peptides aux photons, et beaucoup plus, ainsi que leur capacité à réguler de nombreuses cascades de signalisation en aval impliquées dans la croissance cellulaire, la migration, la différenciation, l’apoptose, la mise à feu cellulaire,^{etc. 2,3}. Compte tenu de leur ubiquité et de leur implication dans une multitude de processus physiologiques, cette famille de récepteurs est de la plus haute importance thérapeutique, mise en évidence par le fait que plus d’un tiers des médicaments prescrits actuellement disponibles ciblent les GPCR⁴. Cependant, ces thérapies existantes ne ciblent qu’un petit sous-ensemble de la superfamille (environ 10%), et la pharmacologie de nombreux GPCRs reste non polluée. En outre, plus de 100 GPCRs existent comme récepteurs orphelins, car ils n’ont pas été jumelés avec une ligand endogène⁵. Ainsi, le dépistage de ligand GPCR est essentiel dans la déorphanasisation et le développement de médicaments, car il ouvre la voie à la découverte et à l’optimisation des plombs, et peut-être à la phase d’essai clinique.

Les méthodes de dépistage du ligand GPCR sont traditionnellement tombées dans l’une des deux catégories, les essais fonctionnels indépendants de G-protein ou de G-protein⁶. La signalisation GPCR est réglementée par des protéines G hétérotrimeriques (G), qui sont activées par l’échange de GTP contre le PIB lié sur le sous-unité^{G 7}. Les signaux du récepteur activé sont transduits par des protéines G via des messagers secondaires, tels que cAMP, Calcium, DAG et IP3, pour servir de médiateur en aval aux effecteurs en aval⁸. La nature des conséquences fonctionnelles de la signalisation de protéine G a été exploitée pour créer des essais cellulaires qui reflètent l’activation des récepteurs. Ces méthodes, qui mesurent les événements proximal (directs) ou distal (indirects) dans la signalisation des protéines G, sont le plus fréquemment utilisées pour le dépistage du ligand GPCR et ont été principalement utilisées dans des études de désorphanasisation⁶. Parmi les exemples d’essais qui mesurent directement l’activation de la protéine G négociée par le GPCR, mentionnons l’essai de liaison [35S]GTP-S, qui mesure la liaison d’un TPL GTP par radiolacs et non hydrolysable analogique au sous-unité de G, et les sondes de transfert d’énergie par résonance de la société de développement et de bioluminescence (FRET/BRET, respectivement) pour surveiller les interactions GPCR-G ET Gô/G, qui ont gagné plus de traction au cours des années^9,10. Les essais qui surveillent les événements distal sont les outils les plus couramment utilisés pour le profilage du GPCR; par exemple, les essais de cAMP et d’IP1/3 mesurent l’accumulation intracellulaire des messagers secondaires dépendants de la protéine G, tandis que [Ca^{2 ]}flux et essais de reporter impliquant des éléments de réponse spécifiques impliqués dans l’activation de la protéine G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) examinent les événements plus en aval de la cascade de signalisation¹¹. Alors que la plupart des essais susmentionnés peuvent être effectués à un niveau de haut débit, sont assez sensibles, et se vantent de certains avantages spécifiques à l’analyse (par exemple, la discrimination entre les agonistes complets/partiels, les antagonistes neutres et les agonistes inverses dans le cas de la liaison GTP-S, ou la fonctionnalité d’analyse sur les cellules vivantes telles que [Ca²] et IP1/3)⁶, il n’y a malheureusement pas de méthodes existantes dépendantes de la protéine G qui s’agencent à l’interrogatoire de l’ensemble du GPCR-ome. Cela est en grande partie dû à l’accouplement indigène de plusieurs sous-familles de protéines G aux GPCRs, ce qui entraîne la signalisation à plusieurs cascades et le couplage inconnu de G-protéine au GPCRs orphelins. Pour atténuer ce problème, des essais ont été développés pour forcer le couplage promiscuité de la protéine G par le biais d’une seule lecture commune de signalisation, comme le cAMP, et le Ca^2MD,bien que la plupart d’entre eux soient à faible débit¹².

Un aspect important du cycle de vie du GPCR est l’arrêt de la signalisation dépendante de la protéine G, qui se produit en grande partie par le recrutement de ‘arrestins qui induit la dissociation de la protéine G, et finalement désensibilisant le récepteur, qui est ciblé pour l’internalisation enduite de clathrine¹³. Les isoformes les plus omniprésents exprimés de l’arrêt sont les non-visuels ‘arrestin1 et ‘arrestin2, également désignés comme arrestin-2 et arrestin-3, respectivement¹⁴. Entrez les essais à base de cellules indépendantes de G-protein, qui ajoutent une nouvelle dimension au dépistage de ligand DE GPCR ; le trafic de récepteurs, la cellule entière sans étiquette et les essais de recrutement d’arrestation sont tous des exemples notables. Les essais de trafic GPCR emploient des ligands étiquetés fluorophore ou des anticorps co-intériorisés ciblant le récepteur^15,tandis que les essais de cellules entières sans étiquette utilisent des biocapteurs qui traduisent les changements cellulaires induits par la liaison ligand en sorties quantifiables, telles que les signaux électriques ou optiques¹⁶. Notamment, la quintessence GPCR- -arrestin interactions façon de l’essai de recrutement ‘-arrestin comme un outil attrayant dans le répertoire des essais fonctionnels¹⁷. Le système Tango, développé pour la première fois par Barnea et coll. il y a seulement dix ans, implique l’introduction de trois éléments génétiques exogènes : une fusion protéique consistant en un 2e jour avec une protéase du virus de l’échage du tabac (TEVp), un transactivateur de tétracycline (TTA) qui est attaché à un GPCR par l’intermédiaire d’un virus de l’échage du tabac le site de clivage de protease (TEVcs) et est précédé d’une séquence du C-terminus du récepteur de vasopressine V2 (queue V2) pour favoriser le recrutement d’arrestin, et d’un gène de luciferase reporter dont la transcription est déclenchée par le translocation du facteur de transcription tTA au noyau, qui est libéré de l’ancrage de la membrane à la suite du recrutement de ‘arrestin2 ‘ (figure 1)¹⁸. Les lectures quantitatives de l’activation du GPCR et du recrutement de l’arrêt2 peuvent ensuite être déterminées par la lecture pour la luminescence. Une distinction notable est que si le trafic de récepteurs et les méthodes cellulaires entières sans étiquette sont relativement faible débit, le Tango a plusieurs avantages, y compris la lecture sélective qui est spécifique au récepteur cible et la sensibilité due à l’intégration du signal, qui en font un candidat approprié pour le dépistage de ligand sur une plus grande échelle¹⁸.

Compte tenu de ces caractéristiques stratégiques, Kroeze et coll. ont développé PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), une plate-forme open-source à haut débit qui utilise l’approche Tango pour profiler le GPCR-ome médicamentable d’une manière parallèle et simultanée¹⁹. Exploitant le recrutement « promiscuité » de l’arrêt2 à presque tous les GPCR, PRESTO-Tango est le premier de son genre en termes d’essais fonctionnels à base de cellules, permettant un dépistage rapide « de premier tour » des composés de petites molécules dans presque tous les GPCRs non olfactifs, y compris les orphelins, indépendamment du couplage sous-familial de la G-protéine.