חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

G-חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs) מהווים את המשפחה הגדולה והמגוונת ביותר של חלבונים transממברני, הפעלה כממשקי תקשורת בין תא לסביבתו¹. רב-תכליתיות של GPCRs מודגשת על ידי היכולת שלהם לזהות מגוון מגוון של ליגנדס – מ נוירוטרנסמיטורים כדי נוקלאוטידים, פפטידים לפוטונים, ועוד רבים – כמו גם היכולת שלהם להסדיר מפלים רבים במורד הזרם מעורב בצמיחה תאית, הגירה, בידול, אפופטוזיס, תא ירי, וכו ‘^2,3. בהתחשב הייתה שלהם ומעורבות בהמון תהליכים פיסיולוגיים, משפחת הקולטן הזאת היא בעלת חשיבות טיפולית מירבית, לראווה על ידי העובדה כי יותר משליש של כרגע זמין תרופות מרשם היעד GPCRs⁴. עם זאת, הtherapeutics הקיימים האלה מכוונים רק לקבוצת משנה קטנה של סופרמשפחה (מוערך של 10%), והפרמקולוגיה של GPCRs רבים נותרה ללא מובהר. יתר על כן, יותר מ 100 GPCRs להתקיים כמו קולטנים יתומים, כפי שהם לא התאימו עם ליגני אנדוגניים⁵. כך, gpcr ליגנד הקרנה היא קריטית בדאוראנזציה ופיתוח התרופה, כפי שהוא מפעיל את הדרך לקראת גילוי המוביל ואופטימיזציה, ואולי לשלב ניסוי קליני.

שיטות ל-gpcr ליגנד ההקרנה באופן מסורתי נפלו באחת משתי קטגוריות, g-חלבון תלוי או g-חלבון בלתי תלוי תפקודית מספר⁶. האיתות gpcr מוסדר על ידי heterotrimeric G-חלבונים (Gαβγ), אשר מופעלים על ידי חילופי gtp עבור התוצר המאוגד על gα יחידת⁷. אותות מן הקולטן המופעל הם התמרה ידי G-חלבונים באמצעות שליחים משניים, כגון מחנה, סידן, דאג, ו IP3, כדי לתווך איתות במורד הזרם במורד הזרם⁸. האופי של ההשלכות הפונקציונליות של מאותת G-חלבון נוצל כדי ליצור תא מבוסס בחני כי לשקף את הפעלת הקולטן. שיטות אלה, אשר למדוד הקרובות (ישיר) האירועים (עקיף) מערכת איתות G-חלבון, הם בשימוש התכוף ביותר GPCR ליגיון ו כבר המועסקים בעיקר במחקרים deהניניזציה⁶. דוגמאות של בחני אומר כי באופן ישיר למדוד gpcr-מתווך G-חלבון הפעלה כוללים את שיטת הכריכה של [35s] GTPγS, אשר מודד את הכריכה של רדיויניום ו-hydrolyzable gtp אנלוגי ליחידת המשנה gα, ו förster/ביולומינסנציה העברת אנרגיה (לדאוג/ברט, בהתאמה) רגשים כדי לנטר gpcr-gα ו gα/Gγ אינטראקציות, אשר כבר צובר המתיחה על השנים^9,10. Assays כי ניטור האירועים הם הכלים הנפוצים ביותר עבור פרופיל GPCR; לדוגמה, מחנה ו IP1/3 בחני למדוד תאיים הצטברות של G-חלבון שליחים משניים תלויים, בעוד [Ca^{2 +}] השטף הכתב בחני מעורבים אלמנטים תגובה ספציפיים מעורב בהפעלת G-חלבון (היצור, nfat-RE, sre, srf-re) לבחון את האירועים עוד במורד הזרם איתות¹ בעוד שרוב האמור לעיל ניתן לבצע ברמת תפוקה גבוהה, הם רגישים למדי, ומתגאים ביתרונות מסוימים של שיטה מסוימת (למשל, הפליה בין האגוניסטים מלאים/חלקיים, אנטוניסטים ניטרליים ו אגוניסטים הופכי במקרה של איגוד GTPγS, או לספק פונקציונליות על תאים חיים כגון [Ca^{2 +}] ו IP1/3)⁶, למרבה הצער לא קיים שיטות התלויות g-חלבון ההולם את החקירה זה בעיקר בשל צימוד מקורי של משפחות משנה G-חלבון GPCRs, וכתוצאה מכך איתות על מפלי מספר וצימוד G-חלבון לא ידוע ב GPCRs יתום. כדי להמתיק את הבעיה, שפותחה כדי לכפות צימוד G-חלבון מופקר באמצעות איתות יחיד משותף הקריאה-out, כגון מחנה, ו-Ca^{2 +}, למרות שרובם הם תפוקה נמוכה¹².

היבט חשוב של מחזור החיים GPCR הוא לסיום של האיתות התלוי בחלבון G, אשר מתרחשת בחלק הגדול באמצעות גיוס של β-הפיגור אשר מעורר את הדיסוציאציה של G-חלבון, ובסופו של דבר הפחתת הרגישות של הקולטן, אשר מיועדת עבור הפנמה מצופה קלטרין¹³. הבלתי-מβ ביותר בעלי הצורה האוביייתית ביותר, הם הβ-arrestin1 וβ-arrestin2, מסומנים גם כפיגור של 2 ופיגור-3, בהתאמה ל^-14. הזן G-חלבון עצמאי מבוסס תא המבוסס, אשר מוסיפים ממד חדש GPCR ליגיון והקרנה; הקולטן הסחר, תא שלם ללא תווית, ו β מפיגור הגיוס מוסר הם כל הדוגמאות הבולטות. Gpcr סחר בחני מעסיקים שימוש fluorophore מתויג ליגטים או שיתוף הפניהפנטים מיקוד הקולטן¹⁵, ואילו התווית של תא שלם חינם השימוש בביוחיישנים לתרגם שינויים סלולריים המושרה על ידי ligands קשירה לתוך כימות תפוקות, כגון אותות חשמליים או אופטיים¹⁶. בעיקר, התמציתי gpcr-β-מפיגור האינטראקציות אופנה הβ מפיגור שיטת הגיוס ככלי אטרקטיבי ברפרטואר של בחני פונקציונלי¹⁷. מערכת הטנגו, שפותחה לראשונה על ידי ברנע ואח ‘. רק לפני עשור, כרוכה המבוא של שלושה אלמנטים גנטיים אקסוסוגני: היתוך חלבון המורכב β-arrestin2 עם וירוס איכול הטבק פרוטאז (tevp), טטרציקלין transactivator (tTA) כי הוא קשור gpcr באמצעות וירוס איכול הנגיף פרוטאז באתר (בטביה) והוא לפניו על ידי רצף מ-C הטרמינוס של הקולטן v2 וזופרסין סין (v2 זנב) כדי לקדם את הגיוס הפיגור, ואת הכתב הגן לוציפראז אשר שעתוק מופעלות על ידי ה tTA שעתוק גורם הטרנסלוקציה לגרעין, אשר שוחרר מן הקרום עיגון בעקבות גיוס β-arrestin2 (איור 1)¹⁸. קריאות כמותי של הפעלה GPCR ו-β-arrestin2 ניתן לקבוע לאחר מכן על ידי קריאה לאור. הבחנה בולטת היא שבזמן הסחר בקולטן ושיטות התא ללא תווית שלמות הם בעלי תפוקה נמוכה יחסית, לטנגו יש מספר יתרונות, כולל לקריאה סלקטיבית כי הוא ספציפי קולטן היעד ואת הרגישות בשל שילוב אותות, מה שעושה את זה מועמד מתאים עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה גדול יותר¹⁸.

לאור התכונות האסטרטגיות הללו, Kroéet al. פיתח-טנגו (קולטן מקבילי-ביטוי ome והקרנה דרך Transcript פלט-טנגו), פלטפורמת הקוד הפתוח של תפוקה גבוהה המשתמשת בגישה טנגו לפרופיל druggable GPCR-ome באופן מקבילי וסימולטני¹⁹. ניצול “מופקר” הגיוס של β-arrestin2 כמעט כל GPCRs, פרסטו-טנגו הוא הראשון-של-שלה מסוג במונחים של מבוסס התא assays, הפעלת מהירה “בסיבוב הראשון” הקרנה של תרכובות מולקולה קטנה בכמעט כל הריח הGPCRs, כולל יתומים, עצמאית של G-חלבון צימוד משפחה.