Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) vormen de grootste en meest diverse familie van transmembraan eiwitten, die werken als communicatie-interfaces tussen een cel en zijn omgeving¹. De veelzijdigheid van GPCRs wordt benadrukt door hun vermogen om een divers scala van ligands-detecteren-van neurotransmitters tot nucleotiden, peptiden tot fotonen, en nog veel meer-evenals hun vermogen om tal van downstream signalering cascades die betrokken zijn bij cellulaire groei, migratie, differentiatie, apoptose, cel vuren, etc.^2,3te reguleren. Gezien hun alomtegenwoordigheid en betrokkenheid bij een veelheid van fysiologische processen, deze receptor familie is van het grootste therapeutische belang, tentoongesteld door het feit dat meer dan een derde van de momenteel beschikbare voorgeschreven medicijnen richten GPCRs⁴. Echter, deze bestaande therapieën alleen gericht op een kleine subset van de superfamilie (naar schatting 10%), en de farmacologie van veel GPCRs blijft onopgehelderd. Bovendien bestaan er meer dan 100 GPCRs als weesreceptoren, omdat ze niet zijn gekoppeld aan een endogene ligand⁵. Zo is GPCR ligand screening van cruciaal belang in deorphanisatie en de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat het de weg naar loodontdekking en -optimalisatie, en mogelijk naar de klinische onderzoeksfase, effent.

Methoden voor GPCR ligand screening zijn traditioneel gedaald in een van de twee categorieën, G-eiwit afhankelijk of G-eiwit onafhankelijke functionele testen⁶. GPCR-signalering wordt geregeld door heterotrimeric G-eiwitten (Gαβγ), die worden geactiveerd door de uitwisseling van GTP voor het BBP gebonden op de Gα-subeenheid⁷. Signalen van de geactiveerde receptor worden door G-eiwitten via secundaire boodschappers, zoals cAMP, Calcium, DAG en IP3, omgezet om downstream signalering te bemiddelen bij downstream-effectoren⁸. De aard van de functionele gevolgen van G-eiwitsignalering is benut om celgebaseerde testen te creëren die receptoractivering weerspiegelen. Deze methoden, die proximale (directe) of distale (indirecte) gebeurtenissen in G-eiwitsignalering meten, worden het vaakst gebruikt voor GPCR ligandscreening en zijn voornamelijk werkzaam in deorphanisatiestudies⁶. Voorbeelden van tests die rechtstreeks gpcr-gemedieerde G-eiwit activering meten zijn de [35S]GTPγS bindende test, die de binding van een radiolabeled en niet-hydrolyzable GTP analoog aan de Gα subunit, en Förster / bioluminescentie resonantie energieoverdracht (FRET / BRET, respectievelijk) sondes meet om GPCR-Gα en Gα/Gγ interacties te monitoren, die in de loop der jaren^9,10meer tractie hebben gekregen . Tests dat monitordistale gebeurtenissen de meest gebruikte tools zijn voor GPCR-profilering; cAMP en IP1/3-testen meten bijvoorbeeld intracellulaire accumulatie van G-eiwit afhankelijke secundaire boodschappers, terwijl [Ca²⁺] flux- en reportertests met specifieke responselementen die betrokken zijn bij de activering van G-eiwit (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) gebeurtenissen verder onderzoeken stroomafwaarts de signaleringscascade¹¹. Hoewel de meeste bovengenoemde tests op een hoog doorvoerniveau kunnen worden uitgevoerd, zijn vrij gevoelig, en beschikken over bepaalde testspecifieke voordelen (bijvoorbeeld discriminatie tussen full/partagonisten, neutrale antagonisten en omgekeerde agonisten in het geval van GTPγS binding, of testfunctionaliteit op levende cellen zoals [Ca²⁺] en IP1/3)^6,er zijn helaas geen bestaande G-eiwit afhankelijke methoden die passen bij de ondervraging van de gehele druggable GPCR-ome. Dit is grotendeels te wijten aan de inheemse koppeling van meerdere G-eiwit subfamilies aan GPCRs, wat resulteert in signalering bij verschillende cascades en de onbekende G-eiwit koppeling bij wees-GPCRs. Om dit probleem te verzachten, zijn tests ontwikkeld om promiscue G-eiwitkoppeling te dwingen door middel van een gemeenschappelijke signaleringsuitlezing, zoals cAMP, en Ca²⁺, zij het dat de meeste van hen een lage doorvoer hebben¹².

Een belangrijk aspect van de GPCR-levenscyclus is de beëindiging van G-eiwitafhankelijke signalering, die voor een groot deel plaatsvindt door de aanwerving van β-arrestinen die dissociatie van het G-eiwit induceert, en uiteindelijk de receptor desensibiliseren, die is gericht op clathrin-coated internalisatie¹³. De meest alomtegenwoordig uitgedrukte isovormen van β-arrestinzijn de niet-visuele β-arrestin1 en β-arrestin2, ook aangeduid als arrestin-2 en arrestin-3, respectievelijk¹⁴. Voer G-eiwit onafhankelijke cel-gebaseerde tests, die een nieuwe dimensie toe te voegen aan GPCR ligand screening; receptor handel, label-vrije hele cel, en β-arrestin werving testen zijn allemaal opmerkelijke voorbeelden. GPCR-smokkeltests maken gebruik van fluorophore-gelabelde liganden of co-geïnternaliseerde antilichamen gericht op de receptor¹⁵, terwijl labelvrije hele celtesten biosensoren gebruiken die cellulaire veranderingen vertalen die door ligandbinding worden veroorzaakt in kwantificeerbare uitgangen, zoals elektrische of optische signalen¹⁶. Met name, typische GPCR-β-arrestin interacties mode de β-arrestin recruitment test als een aantrekkelijk instrument in het repertoire van functionele testen¹⁷. Het Tango-systeem, voor het eerst ontwikkeld door Barnea et al. slechts tien jaar geleden, omvat de introductie van drie exogene genetische elementen: een eiwitfusie bestaande uit β-arrestin2 met een tabak etch virus protease (TEVp), een tetracycline transactivator (tTA) die via een tabak aan een GPCR is gebonden etsvirus protease decolleté site (TEVcs) en wordt voorafgegaan door een sequentie uit de C-terminus van de V2 vasopressine receptor (V2 staart) om arrestaties bij werving te bevorderen, en een reporter luciferase gen waarvan de transcriptie wordt geactiveerd door de tTA transcriptiefactor translocatie naar de kern, die na β-arrestin2 aanwerving(figuur 1) 18 wordt bevrijd van de membraanverankering ( figuur 1 )¹⁸. Kwantitatieve metingen van GPCR-activering en β-arrestin2-rekrutering kunnen vervolgens worden bepaald door te lezen voor luminescentie. Een opmerkelijk onderscheid is dat, terwijl receptorhandel en labelvrije hele celmethoden relatief lage doorvoer zijn, de Tango verschillende voordelen heeft, waaronder selectieve uitlezing die specifiek is voor de doelreceptor en gevoeligheid als gevolg van signaalintegratie, waardoor het een geschikte kandidaat is voor ligandscreening op grotere schaal¹⁸.

Met het oog op deze strategische kenmerken ontwikkelden Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), een high-throughput open-source platform dat de Tango-aanpak gebruikt om de druggable GPCR-ome parallel en gelijktijdig te profileren¹⁹. PreSTO-Tango maakt gebruik van de “promiscue” rekrutering van β-arrestin2 voor bijna alle GPCRs, en is de eerste-van-zijn-soort in termen van op cellen gebaseerde functionele testen, waardoor snelle “eerste ronde” screening van kleine molecuulverbindingen bij bijna alle niet-reukgvr’s, inclusief wezen, onafhankelijk van de G-eiwit subfamiliekoppeling mogelijk is.