Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы

В этом отчете представлено подробное описание серийного протокола добавления, разработанного для количественной оценки активации рецептора белка, индуцированного Г-жа (GPCR) в правильно выращенных клетках по измерениям без этикетки импеданса. G белковые рецепторы (GPCRs) участвуют во множестве физиологических функций и заболеваний человека¹. Из-за этого и их хорошей доступности на поверхности клетки, GPCRs являются одной из наиболее важных целей наркотиков. Эта оценка находит свое отражение в, по оценкам, число 700 утвержденных препаратов, ориентированных на GPCRs, что эквивалентно 35%-ной доле на всех продаваемых препаратах^2.

Разработка новых препаратов включает в себя два центральных процесса: i) идентификацию и функциональную характеристику биологических молекул-мишеней и ii) обнаружение новых свинцовых веществ и их развитие в управляемые препараты. В обоих процессах необходимы эффективные методы количественной оценки взаимодействий с целевыми препаратами и последующего биологического реагирования. Различные этапы доклинического процесса разработки препарата используют различные методы анализа, начиная от исследований биомолекулярного взаимодействия между препаратом и мишенями, по сравнению с функциональными исследованиями клеток в культуре, экспериментами на вырезанном органном материале или целых животных. И физиологическая значимость, и биологическая сложность увеличиваются с первого до последнего^3. Хотя это общая цель, чтобы свести к минимуму эксперименты на животных, фармакологические исследования с использованием изолированных органов из лабораторных животных или даже целых животных считаются неизбежными, чтобы всесторонне охарактеризовать новых кандидатов наркотиков. С точки зрения аналитического чтения, орган фармакологии исследования обеспечивают дистальный, интегративный “целостный” функциональный ответ высокой физиологической значимости. Недостатком таких экспериментов является то, что они не совместимы с высокой пропускной способностью скрининга по техническим, а также этические причины и были в значительной степени заменены исследования, основанные на культуре клеток in vitro⁴.

Методы количественной оценки активации GPCR в клеточных культурах включают различные химические анализы на основе этикеток, которые конкретно обнаруживают вторых посланников, состояние фосфорилирования вниз по течению сигнальных белков, транскрипционную активацию через определенные транскрипционные факторы или торговлю внутриклеточными рецепторами на основе лигандов^4,5. Недостатком таких анализов на этикетке является необходимость обозначения клеток потенциально вредными красителями или радиоактивными маркерами. Это часто требует выполнения ассеа в качестве конечного определения для времени экспозиции, которое должно быть определено априори. Использование этикетки на основе конечных анализов страдает от этого очень ограниченное и предвзятое время эксперимента и риск того, что химические этикетки и зонды могут вмешиваться в регулярной физиологии клеток – потенциально незамеченным экспериментатором.

В последние годы появились анализы без этикеток для мониторинга активации GPCR, такие как методы на основе импедеданса или оптические методы, применяющие резонансные волноводы, решетки^5,6. Маркировка клеток экспериментально не требуется с этими подходами. Поскольку эти физические считыватели работают на сигналах низкой амплитуды, такие методы считаются неинвазивными, они позволяют осуществлять непрерывный мониторинг клеток потенциально в режиме реального времени, а время наблюдения ограничивается только клеточной культурой, а не считывателем. Подобно считываниям из целых органов, подходы, свободные от этике, обычно сообщают о целостных реакциях клеток, далеко вниз по течению активации рецепторов, когда интеграция по всей сигнальной сети приводит к зависящим от времени, но скорее неспецифическим изменениям в морфологии клеток или перераспределению массы. В то время как impedance основе анализов измерения диэлектрической подписи изменений в форме ячейки^7,8, измерения с помощью резонансных волнообразных решеток чувствительны к изменениям в рефракционном индексе на ячейке субстрата интерфейса, вытекающих из динамического перераспределения массы (DMR)⁹. Интегративный характер делает методы без этикетки чрезвычайно чувствительными к событиям, опосредованным рецепторами, независимо от типа (ы) белка G (G_q,G_i/0, G_s,G_12/13) или q-arrestin, участвующих в сигнальном каскаде⁶ и хорошо подходящих для эндогенных уровней экспрессии рецептора.

В стандартном без этикетке impedance основе анализ клетки adherently выращены в нескольких колодцев с копланарной пленки электродов, отложенных на дне каждого колодца¹⁰. Эти электродные массивы соединены с анализатором импеданса, и реакции клеток на экспериментальный стимул регистрируются из отдельных скважин с помощью временных показаний импеданса. В типичном асссе GPCR лиганд добавляется в индивидуально различных концентрациях к каждому отдельному человеку. Лиганд-индуцированные изменения в курсе времени impedance после этого проанализированы по отношению к характерным характеристикам кривой such as максимальная изменение сигнала, зона под кривой, изменение сигнала в пределах, котор дали интервал времени или наклон кривой на затем указанном пункте времени, для того чтобы количественно количественно потенции ligand и эффективности^11.

Стоимость электродных массивов может ограничить применение этого метода в кампаниях скрининга высокой пропускной силы (HTS). Кроме того, с увеличением числа образцов, которые должны следовать параллельно, количество индивидуальных измерений увеличивается и тем самым уменьшает разрешение времени для каждого колодца постепенно – даже для современных многоканальных записей. В таких условиях быстрая и переходная реакция клеток может избежать измерения. Кроме того, обычный хорошо – один подход концентрации налагает значительное время и фактор затрат на perfused орган-на-чипе или тело-на-чип события в отношении их пригодности в ligand-GPCR анализа взаимодействия.

По этой причине мы разработали пошаговый протокол дозирования, который позволяет записывать полную кривую реакции на дозу активации гЦКр в культурных клеточных монослойах, постоянно отслеживая препятствие одной скважины, в то время как концентрация агониста увеличивается поэтапно. Протокол последовательного агониста значительно увеличивает пропускную стоимость в скважине от одной концентрации до 10 или более концентраций, как показано на текущем примере клеток U-373 MG человека, которые эндогенно выражают рецептор гистамина 1 (H1R). Таким образом, метод имеет потенциал для значительного улучшения пропускной связи в безэтикетки доза-ответ исследований, в то время как разрешение времени сохраняется на инструментальной максимум.