פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

דו ח זה מציג תיאור מפורט של פרוטוקול התוספת הטורית שפותחה עבור כימות החלבון המושרה G-חלבונים בשילוב קולטן (GPCR) הפעלה בתאים מגודלים על ידי תווית ללא מדידות עכבה. מצמידים בחלבון G (GPCRs) מעורבים בהמון תפקודים פיזיולוגיים ומחלות אנושיות¹. בגלל זה והנגישות הטובה שלהם במשטח התאים, GPCRs הן אחת ממטרות הסמים החשובות ביותר. הערכה זו משתקפת במספר מוערך של ~ 700 תרופות שאושרו על-ידי GPCRs, שוות ערך ל-~ 35% שיתוף בכל התרופות המשווקים².

התפתחות התרופות החדשות כוללת שני תהליכים מרכזיים: (i) האפיון ההזדהות והפונקציונלי של מולקולות היעד הביולוגי ו-(ii) גילוי של חומרי הובלה חדשים והתפתחותם לתרופות בניהול. בשני התהליכים, נדרשות שיטות יעילות כדי להעריך את האינטראקציות של מטרות הסמים ואת תגובת המטה הביולוגית הבאה. בשלבים שונים של תהליך פיתוח תרופות טרום-קליני לעשות שימוש בשיטות ניתוח שונות החל ממחקרים ביוקולריות האינטראקציה בין התרופה והיעד, על פני מחקרים פונקציונליים על תאים בתרבות, לניסויים על חומר האיבר המגורש או בעלי חיים שלמים. הן, המשמעות הפיזיולוגית והמורכבות הביולוגית, מגדילות מהראשון ל^-3האחרון. למרות שזו המטרה הכוללת למזער ניסויים בבעלי חיים, מחקרים פרמקולוגיים המשתמשים באברים מבודדים מבעלי חיים מעבדתיים או אפילו בעלי חיים שלמים נחשבים בלתי נמנעים למאפיינים מקיפים של מועמדים חדשים לסמים. במונחים של הבדיקה האנליטית, לימודי האיברים הפרמקולוגיה מספקים תגובה פונקציונלית מההוליסטית ואינטגרטיבית של הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר. חיסרון של ניסויים כאלה הוא שהם לא תואמים הקרנת תפוקה גבוהה עבור טכני, כמו גם סיבות אתיות כבר הוחלף ברובו על ידי מחקרים המבוססים על התרבות תא מבחנה⁴.

שיטות כדי לכמת gpcr הפעלה בתרבויות תאים כוללים שונים מבוססי תוויות כימיים assays, אשר במפורש לזהות שליחים השני, המדינה זרחון במורד החלבונים איתות, הפעלת הפעלה דרך גורמים שעתוק מסוימים או ליגקין המושרה סחר הקולטן תאיים^4,5. החיסרון של התווית המבוססת על תוויות הוא הצורך לתייג את התאים עם צבעים שעלולים להזיק או סמנים רדיואקטיביים. זה דורש לעיתים קרובות להפעיל את התשובה כקביעת נקודת קצה-הגדרה לזמן חשיפה שיש לציין א פריורי. שימוש בנקודת קצה מבוססת תווית סובל מתזמון מאוד מצומצם ומוטה של הניסוי והסיכון שתוויות כימיות והבדיקות עלולות לשבש את הפיזיולוגיה של התא הרגיל – שעלולים להבחין בידי הניסוי.

בשנים האחרונות, לייבל ללא תווית עבור ניטור gpcr הפעלה התפתחה, כמו מבוססי עכבה טכניקות או שיטות אופטיות החלת מדריך גל^התהודההדרכה 5,⁶. התוויות של התאים הינם ניסויים שאינם נדרשים בגישות אלה. כמו אלה הקריאות הפיזיות לפעול על אותות משרעת נמוכה, שיטות כאלה נחשבות לא פולשנית, הם מאפשרים ניטור תאים רציף פוטנציאלי בזמן אמת וזמן התצפית מוגבל רק על ידי תרבות התא לא על ידי הבדיקה. בדומה לקריאות מאיברים שלמים, גישות ללא תווית בדרך כלל לדווח על תגובות התא הוליסטי , במורד הזרם של הפעלת הקולטן כאשר אינטגרציה לאורך כל רשת איתות מוביל לשינויים תלויי זמן אך לא ספציפיים במבנה התא או הפצה המוניים. בעוד מבוסס עכבה מבוססת למדוד את החתימה מדידות של שינויים בצורה תא^7,8, מדידות באמצעות מדריך גל התהודה המדורגים רגישים לשינויים במדד השבירה בממשק התא-מצע הנובע מפצה דינמית המסה (dmr)⁹. התו האינטגרטיבי הופך שיטות ללא תוויות רגישות מאוד לאירועים בתיווך הקולטן ללא קשר לסוג (s) של G חלבון (G_q, g_i/0, g_s, g_12/13) או β-מעורב בדירוג איתות⁶ ומתאים היטב לרמות ביטוי אנדוגני של הקולטן.

בתוך שיטת העכבה הסטנדרטית ללא תווית, התאים גדלים בגדול בצלחות מרובות-היטב עם אלקטרודות לסרט זהב ישור שהופקדו בתחתית כל באר¹⁰. אלה מערכי אלקטרודה מחוברים מנתח עכבה ואת התגובות התאים לגירוי ניסיוני נרשמים מבארות בודדות על ידי קריאות העכבה שנפתרו זמן. ב שיטת GPCR טיפוסית ליגונה מתווסף ריכוזים שונים בנפרד לכל אדם היטב. השינויים המושרה בקורס לאחר העכבה מנותח לאחר מכן ביחס לתכונות עקומות אופייני כגון שינוי האות המקסימלי, שטח תחת עיקול, שינוי האות בתוך מרווח זמן נתון או מדרון של עקומת בנקודת זמן מוגדר, על מנת לכמת את העוצמה של ligand יעילות¹¹.

עלות מערכי האלקטרודה עשויה להגביל את היישום של טכניקה זו בקמפיינים של הקרנת תפוקה גבוהה (hts). יתר על כן, עם מספר גדל והולך של דגימות להיות במקביל, המספר של מדידות בודדות עולה ובכך מפחית את רזולוציית הזמן הזמין עבור כל היטב בהדרגה-אפילו עבור הקלטות רב ערוצי האמנות. תחת תנאים כאלה מהיר התגובות התא ארעי עשוי לברוח מדידה. בנוסף, המקובל אחד היתרונות – גישה ריכוז אחת מטיל משמעות משמעותית הזמן והעלות על מעשה הגוף על שבב או על שבבים התפתחויות על שבב ביחס להתאמה שלהם בניתוח האינטראקציה LIGAND-gpcr.

מסיבה זו, פיתחנו פרוטוקול מינון חורג המאפשר הקלטה של מינון מלאה-תגובה עקומות של הפעלה GPCR המושרה של ליגיום בתוך מונאולאיירס תא תרבותי על ידי ברציפות ניטור עכבה של באר אחת בעוד ריכוז אגוניסט הוא מוגבר צעד. פרוטוקול התוספת של האגוניסט הטורי מגביר באופן משמעותי את התפוקה לכל היותר מריכוז אחד ועד 10 ריכוזים או יותר, כפי שמוצג בדוגמה הנוכחית של התאים האנושיים U-373 MG, אשר מבטאים באופן מובהק את הקולטן להיסטמין 1 (H1R). לפיכך, לשיטה יש פוטנציאל לשפר באופן משמעותי את התפוקה במחקרים של מינון ללא תווית, בעוד שרזולוציית הזמן נשמרת במקסימום האינסטרומנטלי.