Protocole de dosage stepwise pour un débit accru dans les essais GPCR sans étiquette

Ce rapport présente une description détaillée d’un protocole d’addition en série développé pour la quantification de l’activation du récepteur couplé de protéine G induite par ligand (GPCR) dans les cellules cultivées adhérente par des mesures d’impédance sans étiquette. Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont impliqués dans une multitude de fonctions physiologiques et de maladies humaines¹. Pour cette raison et leur bonne accessibilité à la surface des cellules, les GPCR sont l’une des cibles les plus importantes en matière de médicaments. Cette évaluation se reflète dans un nombre estimatif de 700 médicaments approuvés ciblant les GPCR, ce qui équivaut à une part de 35 % sur tous les médicaments commercialisés².

Le développement de nouveaux médicaments comprend deux processus centraux : (i) l’identification et la caractérisation fonctionnelle des molécules cibles biologiques, et (ii) la découverte de nouvelles substances de plomb et leur développement dans les médicaments administrables. Dans les deux processus, des méthodes efficaces sont nécessaires pour évaluer quantitativement les interactions médicament-cible et la réponse biologique en aval subséquente. Différentes étapes du processus de développement préclinique de médicaments font usage de différentes méthodes d’analyse allant des études d’interaction biomoléculaire entre le médicament et la cible, sur les études fonctionnelles sur les cellules en culture, aux expériences sur le matériel d’organe excisé ou des animaux entiers. Les deux, la signification physiologique et la complexité biologique augmentent de la première à la seconde³. Bien que l’objectif global soit de minimiser les expériences sur les animaux, les études pharmacologiques utilisant des organes isolés d’animaux de laboratoire ou même d’animaux entiers sont considérées comme inévitables pour caractériser de façon exhaustive les nouveaux médicaments candidats. En termes de lecture analytique, les études pharmacologiques d’organe fournissent une réponse fonctionnelle « holistique » distale et intégrative de la plus haute pertinence physiologique. Un inconvénient de ces expériences est qu’elles ne sont pas compatibles avec le dépistage à haut débit pour des raisons techniques et éthiques et ont été largement remplacées par des études basées sur la culture cellulaire in vitro⁴.

Les méthodes pour quantifier l’activation du GPCR dans les cultures cellulaires comprennent différentes analyses chimiques à base d’étiquettes, qui détectent spécifiquement les deuxièmes messagers, l’état de phosphorylation des protéines de signalisation en aval, l’activation transcriptionnelle par l’intermédiaire de certains facteurs de transcription ou le trafic de récepteurs intracellulaires induits par ligand^4,5. Un inconvénient de ces essais basés sur l’étiquette est la nécessité d’étiqueter les cellules avec des colorants potentiellement nocifs ou des marqueurs radioactifs. Cela nécessite souvent l’exécution de l’évaluation comme un point de terminaison-détermination pour un temps d’exposition qui doit être spécifié a priori. L’utilisation d’analyses de points de terminaison basées sur l’étiquette souffre de ce moment très limité et biaisé de l’expérience et du risque que les étiquettes chimiques et les sondes interfèrent avec la physiologie cellulaire régulière, potentiellement inaperçue par l’expérimentateur.

Ces dernières années, des essais sans étiquette pour la surveillance de l’activation du GPCR ont vu le jour, comme des techniques basées sur l’impédance ou des méthodes optiques appliquant des grilles de guides d’ondes résonnantes^5,6. L’étiquetage des cellules n’est pas expérimentalement requis avec ces approches. Comme ces réadmissions physiques fonctionnent sur des signaux de faible amplitude, ces méthodes sont considérées comme non invasives, elles permettent une surveillance cellulaire continue potentiellement en temps réel et le temps d’observation n’est limité que par la culture cellulaire et non par la lecture. Semblable aux écoutes d’organes entiers, les approches sans étiquette font généralement état des réponses cellulaires holistiques, loin en aval de l’activation des récepteurs lorsque l’intégration sur l’ensemble du réseau de signalisation entraîne des changements dépendants du temps, mais plutôt non spécifiques dans la morphologie cellulaire ou la redistribution de masse. Considérant que les essais basés sur l’impédance mesurent la signature diélectrique des changements dans la forme des cellules^7,8, les mesures utilisant des grilles de guide d’onde résonnantes sont sensibles aux changements de l’indice de réfraction à l’interface cellule-substrat résultant de la redistribution dynamique de masse (DMR)⁹. Le caractère intégrateur rend les méthodes sans étiquette extrêmement sensibles aux événements médiés par les récepteurs, quel que soit le type de protéine G (G_q, G_i/0, G_s, G_12/13) ou l’arrêt de la signalisation⁶ et bien adapté aux niveaux d’expression endogènes du récepteur.

Dans un jeu d’exemple standard sans étiquette, les cellules sont cultivées de façon adhérente dans des plaques multi-puits avec des électrodes de film d’or coplanaires déposées au fond de chaque puits¹⁰. Ces réseaux d’électrodes sont reliés à un analyseur d’impédance et les réponses cellulaires à un stimulus expérimental sont enregistrées à partir de puits individuels par des lectures d’impédance résolues dans le temps. Dans un exemple typique de GPCR, un ligand est ajouté en concentrations différentes individuellement à chaque puits individuel. Les changements induits par ligand dans le cours de temps d’impédance sont ensuite analysés en ce qui concerne les caractéristiques de la courbe telles que le changement de signal maximal, la zone sous la courbe, le changement de signal dans un intervalle de temps donné ou la pente de la courbe à un point de temps spécifié, afin de quantifier la puissance et l’efficacité du ligand¹¹.

Le coût des réseaux d’électrodes peut limiter l’application de cette technique dans les campagnes de dépistage à haut débit (HTS). En outre, avec un nombre croissant d’échantillons à suivre en parallèle, le nombre de mesures individuelles augmente et réduit ainsi la résolution de temps disponible pour chaque puits progressivement – même pour l’état de l’art des enregistrements multicanaux. Dans de telles conditions, des réponses cellulaires rapides et transitoires peuvent échapper à la mesure. De plus, l’approche conventionnelle , une approche de concentration, impose un facteur de temps et de coût important aux développements perfusés d’organes sur puce ou de corps sur puce en ce qui concerne leur pertinence dans l’analyse de l’interaction ligand-GPCR.

Pour cette raison, nous avons développé un protocole de dosage progressive qui permet l’enregistrement des courbes pleine dose-réponse de l’activation du GPCR induite par ligand dans les monocouches de cellules cultivées en surveillant continuellement l’impédance d’un seul puits tandis que la concentration agoniste est augmentée pas à pas. Le protocole d’addition agoniste en série augmente de manière significative le débit par puits d’une concentration à 10 ou plus, comme indiqué sur l’exemple actuel des cellules humaines U-373 MG, qui expriment endogènement le récepteur de l’histamine 1 (H1R). Ainsi, la méthode a le potentiel d’améliorer considérablement le débit dans les études de dose-réponse sans étiquette, tandis que la résolution de temps est conservée au maximum instrumental.