Stepwise Dosing Protocol voor verhoogde doorvoer in label-vrije impedance-based GPCR-tests

Dit rapport presenteert een gedetailleerde beschrijving van een seriële toevoeging protocol ontwikkeld voor de kwantificering van ligand-geïnduceerde G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) activering in aanhangende cellen door label-vrije impedantie metingen. G eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) zijn betrokken bij een veelheid van fysiologische functies en menselijke ziekten¹. Vanwege deze en hun goede toegankelijkheid aan het celoppervlak, GPCRs zijn een van de belangrijkste drug doelen. Deze beoordeling wordt weerspiegeld in een geschat aantal ~ 700 goedgekeurde geneesmiddelen gericht op GPCRs, gelijk aan een ~ 35% aandeel op alle op de markt gebrachte drugs².

De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen omvat twee centrale processen: i) de identificatie en functionele karakterisering van biologische doelmoleculen, en (ii) de ontdekking van nieuwe loodstoffen en hun ontwikkeling tot administrable drugs. In beide processen zijn efficiënte methoden nodig om interacties met drugsengerichtheid en de daaropvolgende biologische downstreamrespons kwantitatief te evalueren. Verschillende stadia van het preklinische geneesmiddelenontwikkelingsproces maken gebruik van verschillende analysemethoden, variërend van biomoleculaire interactiestudies tussen medicijn en doel, over functionele studies over cellen in de cultuur, tot experimenten op uitgesneden orgaanmateriaal of hele dieren. Beide fysiologische betekenis en biologische complexiteit nemen toe van de eerste naar de laatste³. Hoewel het het algemene doel is om dierproeven te minimaliseren, worden farmacologische studies met behulp van geïsoleerde organen van proefdieren of zelfs hele dieren onvermijdelijk geacht om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen volledig te karakteriseren. In termen van analytische uitlezing, orgaan farmacologie studies bieden een distale, integratieve “holistische” functionele respons van de hoogste fysiologische relevantie. Een nadeel van dergelijke experimenten is dat zij om zowel technische als ethische redenen niet verenigbaar zijn met een hoge doorvoerscreening en grotendeels zijn vervangen door studies op basis van in vitro celcultuur⁴.

Methoden om gpcr-activering in celculturen te kwantificeren, omvatten verschillende op etiketten gebaseerde chemische tests, die specifiek tweede boodschappers detecteren, fosforylatietoestand van downstream-signaaleiwitten, transcriptieactivering via bepaalde transcriptiefactoren of ligand-geïnduceerde intracellulaire receptorhandel^4,5. Een nadeel van dergelijke op etiketten gebaseerde tests is de noodzaak om de cellen te etiketteren met mogelijk schadelijke kleurstoffen of radioactieve markers. Dit vereist vaak het uitvoeren van de test als een eindpunt-bepaling voor een blootstelling stijd die moet worden opgegeven a priori. Met behulp van label-gebaseerde eindpunt testen lijdt aan deze zeer beperkte en bevooroordeelde timing van het experiment en het risico dat chemische etiketten en sondes kunnen interfereren met de reguliere celfysiologie – potentieel onopgemerkt door de experimentator.

In de afgelopen jaren zijn labelvrije tests voor het monitoren van GPCR-activatie naar voren gekomen, zoals impedantiegebaseerde technieken of optische methoden die resonante waveguide roosters toepassen^5,6. Etikettering van de cellen is experimenteel niet nodig met deze benaderingen. Aangezien deze fysieke uitlezingen werken op lage amplitude signalen, dergelijke methoden worden beschouwd als niet-invasief, ze zorgen voor continue cel monitoring potentieel in real time en de observatie tijd wordt alleen beperkt door de celcultuur niet door de uitlezing. Vergelijkbaar met uitlezingen van hele organen, label-vrije benaderingen vaak verslag over holistische celreacties, ver stroomafwaarts van receptor activering wanneer de integratie langs het hele signaleringsnetwerk leidt tot tijd-afhankelijke, maar eerder onspecifieke veranderingen in celmorfologie of massa herverdeling. Overwegende dat op impedantie gebaseerde tests de diëlektrische signatuur van veranderingen in celvorm^7,8meten , metingen met behulp van resonerende golfgeleidingsroosters gevoelig zijn voor veranderingen in de brekingsindex op de celsubstraatinterface als gevolg van dynamische massaherverdeling (DMR)⁹. Het integrerende karakter maakt labelvrije methoden uiterst gevoelig voor receptorgemedieerde gebeurtenissen, ongeacht het type(en) van G-eiwit (G_q, G_i/0, G_s, G_12/13) of β-arrestine die betrokken zijn bij de signaleringcascade⁶ en goed geschikt voor eneexpressieniveaus van de receptor.

In een standaard label-vrije impedantie-gebaseerde test de cellen zijn adherently geteeld in multi-well platen met coplanar goud-film elektroden afgezet op de bodem van elke put¹⁰. Deze elektrodearrays zijn verbonden met een impedantieanalyzer en de celreacties op een experimentele stimulus worden geregistreerd vanuit individuele putten door door de tijd opgeloste impedantiemetingen. In een typische GPCR-test wordt een ligand toegevoegd in individueel verschillende concentraties aan elk individu goed. De ligand-geïnduceerde veranderingen in de impedantie tijdcursus worden vervolgens geanalyseerd met betrekking tot karakteristieke curvekenmerken zoals maximale signaalverandering, gebied onder de curve, signaalverandering binnen een bepaald tijdsinterval of helling van de curve op een bepaald tijdspunt, om de potentie en werkzaamheid van de ligand te kwantificeren¹¹.

De kosten van de elektrodearrays kunnen de toepassing van deze techniek beperken in HTS-campagnes (high throughput screening). Bovendien neemt het aantal afzonderlijke metingen toe en vermindert daarmee geleidelijk de beschikbare tijdsresolutie voor elke put – zelfs voor state-of-the-art meerkanaalsopnamen. Onder dergelijke omstandigheden kunnen snelle en voorbijgaande celreacties aan de meting ontsnappen. Bovendien, de conventionele een goed – een concentratie benadering legt een aanzienlijke tijd en kostenfactor op perfused organ-on-chip of body-on-chip ontwikkelingen met betrekking tot hun geschiktheid in ligand-GPCR interactie analyse.

Om deze reden ontwikkelden we een stapsgewijs doseringsprotocol dat het registreren van volledige dosisresponscurven van ligand-geïnduceerde GPCR-activering in gekweekte celmonolagen mogelijk maakt door de impedantie van één enkele put continu te monitoren, terwijl de agonistconcentratie stapsgewijs wordt verhoogd. Het seriële agonist toevoegingsprotocol verhoogt de doorvoer per put aanzienlijk van één concentratie naar 10 of meer concentraties, zoals blijkt uit het huidige voorbeeld van menselijke U-373 MG-cellen, die de histamine 1-receptor (H1R) endoopeerig uitdrukken. Zo heeft de methode het potentieel om de doorvoer in labelvrije dosisresponsstudies aanzienlijk te verbeteren, terwijl de tijdsresolutie op het instrumentele maximum wordt gehandhaafd.