Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü
Summary
Bu protokol, etiketsiz empedans ölçümleri kullanılarak tek bir mikroelektrot üzerinde yetiştirilen tek bir hücre tabakasından agonist kaynaklı GPCR aktivasyonu için tam doz-yanıt ilişkilerinin gerçek zamanlı kaydını göstermektedir. Yeni dosing şeması, zaman çözümlü zaman kaybı olmadan iş buzunu önemli ölçüde artırır.
Abstract
Etiketsiz empedans bazlı tahliller, hücre kültürü deneylerinde ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunu invaziv olmayan olarak incelemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, aygıta bağlı zaman çözünürlüğü yle gerçek zamanlı hücre izleme sağlar ve bu durum çok yüksek derecede otomatiktir. Ancak, örnek sayıları nidik aldığında (örneğin, çeşitli ligandlar için doz-yanıt çalışmaları), tek kullanımlık elektrot dizilerinin maliyeti ve sıralı iyi kuyu kayıtları için kullanılabilir zaman çözünürlüğü sınırlayıcı hale gelebilir. Bu nedenle, burada önemli ölçüde etiket içermeyen GPCR tahlilçıktısını artırmak için potansiyele sahip bir seri agonist ek protokolü sıyoruz. Seri agonist ekleme protokolü kullanılarak, bir GPCR agonist sürekli örnek empedans (agonist modu) izlerken tek bir hücre katmanına artan konsantrasyonları artarda eklenir. Bu seri yaklaşım ile, artık sadece tek bir hücre tabakasından bir GPCR agonist için tam doz-yanıt eğrisi kurmak mümkündür. Seri agonist ekleme protokolü farklı GPCR kaplin tipleri, Gq Gi/0 veya Gs için geçerlidir ve çalışma altındaki reseptörün rekombinant ve endojen ekspresyon düzeyleri ile uyumludur. GPCR antagonistleri tarafından reseptör blokesi de değerlendirilebilir (antagonist mod).
Introduction
Bu rapor, bağlı olarak yetiştirilen hücrelerde ligand kaynaklı G protein-çiftreseptör (GPCR) aktivasyonunun etiketsiz empedans ölçümleri ile ölçülmesi için geliştirilmiş seri ek protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. G protein-coupled reseptörleri (PcF) fizyolojik fonksiyonlar ve insan hastalıkları1çok sayıda yer almaktadır. Bu ve hücre yüzeyinde ki iyi erişilebilirlik nedeniyle, GPCR en önemli uyuşturucu hedeflerinden biridir. Bu değerlendirme, tüm pazarlanan ilaçlar2~% 35 paya eşdeğer, GPCR hedefleyen ~ 700 onaylı ilaçların tahmini sayısı yansıtılır.
Yeni ilaçların geliştirilmesi iki merkezi süreçten oluşur: (i) biyolojik hedef moleküllerin tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu ve (ii) yeni kurşun maddelerin keşfi ve bunların yönetilebilir ilaçlara dönüştürülmesi. Her iki süreçte de, ilaç hedef etkileşimlerini ve sonraki biyolojik aşağı tepkiyi nicel olarak değerlendirmek için etkin yöntemler gereklidir. Klinik öncesi ilaç geliştirme sürecinin farklı aşamalarında, ilaç ve hedef arasındaki biyomoleküler etkileşim çalışmalarından kültürdeki hücreler üzerinde yapılan fonksiyonel çalışmalara, eksise organ materyali veya bütün hayvanlar üzerinde deneylere kadar farklı analiz yöntemlerini kullanmaktadır. Her ikisi de, fizyolojik önemi ve biyolojik karmaşıklığı eski den ikinci3artış . Hayvan deneylerini en aza indirmek genel hedef olsa da, laboratuvar hayvanlarından ve hatta bütün hayvanlardan izole edilmiş organları kullanan farmakolojik çalışmalar, yeni ilaç adaylarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kaçınılmaz kabul edilmektedir. Analitik okuma açısından, organ farmakolojisi çalışmaları en yüksek fizyolojik alaka distal, bütünleştirici “bütünleştirici” fonksiyonel yanıt sağlar. Bu tür deneylerin bir dezavantajı, teknik yanı sıra etik nedenlerle yüksek iş elde tarama ile uyumlu değildir ve büyük ölçüde in vitro hücre kültürü4dayalı çalışmalar ile ikame edilmiştir.
Hücre kültürlerinde GPCR aktivasyonunu ölçmek için kullanılan yöntemler arasında, özellikle ikinci habercileri tespit eden farklı etiket tabanlı kimyasal tahliller, aşağı akım sinyal proteinlerinin fosforilasyon durumu, belirli transkripsiyon faktörleri veya ligand kaynaklı hücre içi reseptör ticareti ile transkripsiyonel aktivasyon4,5sayılabilir. Bu tür etiket tabanlı tahlillerin bir dezavantajı, hücreleri zararlı boyalar veya radyoaktif belirteçlerle etiketleme zorunluluğudur. Bu genellikle bir prioribelirtilmesi gereken bir pozlama süresi için bir bitiş noktası belirleme olarak tayini çalıştırmayı gerektirir. Etiket tabanlı uç nokta testlerinin kullanılması, deneyin bu çok sınırlı ve önyargılı zamanlamasından ve kimyasal etiketlerin ve probların normal hücre fizyolojisini etkileyebilecek riskten muzdaripdir – deneyci tarafından fark edilmeden.
Son yıllarda, GPCR aktivasyon izlemek için etiketsiz tahliller ortaya çıkmıştır, empedans tabanlı teknikler veya rezonans dalga kılavuzu ızgaraları uygulayan optik yöntemler gibi5,6. Bu yaklaşımlarla hücrelerin etiketlenmesi deneysel olarak gerekli değildir. Bu fiziksel okumalar düşük genlikli sinyaller üzerinde çalıştığından, bu tür yöntemler invaziv olmayan olarak kabul edilir, onlar potansiyel olarak gerçek zamanlı olarak sürekli hücre izleme için izin ve gözlem süresi sadece hücre kültürü ile sınırlıdır okuma ile değil. Tüm organlardan gelen okumalara benzer şekilde, etiketsiz yaklaşımlar genellikle bütünsel hücre yanıtları hakkında rapor, tüm sinyal ağı boyunca entegrasyon zamana bağlı ama hücre morfolojisi veya kitle yeniden dağıtımında zamana bağlı olmayan değişikliklere yol açtığında reseptör aktivasyonunun çok aşağısında. Empedans tabanlı tahliller hücre şekli7,8, rezonans dalga kılavuzu ızgaraları kullanarak ölçümler istatiksel imza ölçmek ise dinamik kütle yeniden dağılımı (DMR)9kaynaklanan hücre-substrat arabiriminde kırılma indisi değişikliklere duyarlıdır . İntegratif karakter, G proteininin (Gq, Gi/0, Gs, G12/13)veya β-arrestin in sinyalizasyon basamak6 dahil ve reseptörün endojen ekspresyon düzeyleri için uygun ne olursa olsun reseptör aracılı olaylara son derece duyarlı etiketsiz yöntemler yapar.
Standart etiketsiz empedans tabanlı bir teşbimizde hücreler, her kuyunun10’ununaltına biriken koplanar altın film elektrotlarla çok kuyulu plakalarda yapışkan bir şekilde yetiştirilir. Bu elektrot dizileri bir empedans analizörüne bağlanır ve deneysel bir uyarıcıya hücre tepkileri zaman çözümlü empedans okumaları ile bireysel kuyulardan kaydedilir. Tipik bir GPCR tsay bir ligand her bir eye ayrı ayrı farklı konsantrasyonlarda iyi eklenir. Empedans zaman dilimindeki ligand indüklenen değişiklikler daha sonra maksimum sinyal değişimi, eğrinin altındaki alan, belirli bir zaman aralığında ki sinyal değişimi veya eğrinin eğimi gibi karakteristik eğri özelliklerine göre analiz edilir, ligand’ın gücünü ve etkinliğini ölçmek için11.
Elektrot dizilerinin maliyeti, bu tekniğin yüksek iş yapma tarama (HTS) kampanyalarında uygulanmasını sınırlayabilir. Dahası, paralel olarak takip edilecek örnek sayısının artmasıyla, bireysel ölçümlerin sayısı artar ve böylece her bir kuyu için kullanılabilir zaman çözünürlüğünü kademeli olarak azaltır – en son teknoloji deki çok kanallı kayıtlar için bile. Bu koşullar altında hızlı ve geçici hücre yanıtları ölçümden kaçabilir. Buna ek olarak, konvansiyonel bir iyi – bir konsantrasyon yaklaşımı ligand-GPCR etkileşim analizi onların uygunluk açısından perfüzyon organ-on-chip veya vücut-on-chip gelişmeler önemli bir zaman ve maliyet faktörü empoze.
Bu nedenle, agonist konsantrasyonu kademeli olarak artarken tek bir kuyunun empedansını sürekli izleyerek, kültürlü hücre monokatmanlarında ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunun tam doz-yanıt eğrilerinin kaydedilmesini sağlayan adım sallayan bir protokol geliştirdik. Seri agonist ekleme protokolü, histamin 1 reseptörünü (H1R) endojen bir şekilde ifade eden insan U-373 MG hücrelerinin mevcut örneğinde gösterildiği gibi, bir konsantrasyondan 10 veya daha fazla konsantrasyona kadar kuyu başına verimin önemli ölçüde arttırıldığı gibi. Böylece, yöntem önemli ölçüde etiketsiz doz-yanıt çalışmalarda iş bilgililik geliştirmek için potansiyele sahiptir, zaman çözünürlüğü enstrümantal maksimum korunur iken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, aynı reseptör için özel antagonistlerin yokluğunda veya varlığında agonist indüklenen GPCR aktivasyonunun doz-yanıt ilişkisini belirlemek için etiketsiz empedans ölçümleri için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntemin kavramının kanıtı yeni bir yayındasunulmuştur 12. Bilgimiz için in vitro tek bir hücre tabakası kullanarak agonist aracılı GPCR aktivasyonu tam doz-yanıt eğrisi kurulması açıklayan ilk çalışmadır. Bu yaklaşım kaçınılmaz olarak …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Barbara Goricnick ve Nadja Hinterreiter’e hücre culturing ve deneysel çözümlerin hazırlanması nda yardımcı olan lara teşekkür ederiz. Yazarlar minnetle Araştırma Eğitim Grubu 1910 “seçici GPCR ligands tıbbi kimya” Alman Araştırma Vakfı (DFG) hibe numarası 222125149 altında finanse mali destek kabul. JAS özellikle Bavyera Cinsiyet Eşitliği Programı tarafından verilen bir burs için minnettar.
Materials
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
