Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung eines seriellen Additionsprotokolls, das zur Quantifizierung der Liganden-induzierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivierung (GPCR) in anhaftend angebauten Zellen durch etikettenfreie Impedanzmessungen entwickelt wurde. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind an einer Vielzahl physiologischer Funktionen und menschlicher Krankheiten beteiligt¹. Aufgrund dieser und ihrer guten Zugänglichkeit an der Zelloberfläche sind GPCRs eines der wichtigsten Wirkstoffziele. Diese Bewertung spiegelt sich in einer geschätzten Zahl von 700 zugelassenen Arzneimitteln wider, die auf DIE GPCR abzielen, was einem Anteil von 35 % an allen vermarkteten Arzneimitteln entspricht².

Die Entwicklung neuer Medikamente umfasst zwei zentrale Prozesse: (i) die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung biologischer Zielmoleküle und (ii) die Entdeckung neuer Bleisubstanzen und deren Entwicklung zu administrierbaren Arzneimitteln. In beiden Prozessen sind effiziente Methoden erforderlich, um Wirkstoff-Ziel-Wechselwirkungen und die anschließende biologische nachgeschaltete Reaktion quantitativ zu bewerten. Verschiedene Stadien des präklinischen Arzneimittelentwicklungsprozesses nutzen verschiedene Analysemethoden, die von biomolekularen Interaktionsstudien zwischen Medikament und Ziel, über funktionelle Studien an Zellen in der Kultur bis hin zu Experimenten an ausgeschnittenem Organmaterial oder ganzen Tieren reichen. Sowohl die physiologische Bedeutung als auch die biologische Komplexität nehmen von ersterer bis zu letzterer³zu. Obwohl es das übergeordnete Ziel ist, Tierversuche zu minimieren, werden pharmakologische Studien mit isolierten Organen von Labortieren oder sogar ganzen Tieren als unvermeidlich angesehen, um neue Wirkstoffkandidaten umfassend zu charakterisieren. In analytischer Auslesung bieten Organpharmakologiestudien eine distale, integrative “ganzheitliche” funktionelle Reaktion von höchster physiologischer Relevanz. Ein Nachteil solcher Experimente ist, dass sie aus technischen und ethischen Gründen nicht mit einem Hochdurchsatz-Screening kompatibel sind und weitgehend durch Studien auf der Grundlage der In-vitro-Zellkultur4 ersetzt wurden.

Methoden zur Quantifizierung der GPCR-Aktivierung in Zellkulturen umfassen verschiedene etikettenbasierte chemische Assays, die speziell zweite Botenstoffe, Phosphorylierungszustand von nachgeschalteten Signalproteinen, Transkriptionsaktivierung über bestimmte Transkriptionsfaktoren oder Liganden-induzierten intrazellulären Rezeptorenhandel^4,5. Ein Nachteil solcher etikettenbasierter Assays ist die Notwendigkeit, die Zellen mit potenziell schädlichen Farbstoffen oder radioaktiven Markern zu kennzeichnen. Dies erfordert häufig das Ausführen des Assays als Endpunktbestimmung für eine Expositionszeit, die a prioriangegeben werden muss. Die Verwendung von etikettenbasierten Endpunkt-Assays leidet unter diesem sehr begrenzten und voreingenommenen Timing des Experiments und dem Risiko, dass chemische Etiketten und Sonden die reguläre Zellphysiologie stören – möglicherweise unbemerkt vom Experimentator.

In den letzten Jahren sind etikettenfreie Assays zur Überwachung der GPCR-Aktivierung entstanden, wie Impedanz-basierte Techniken oder optische Methoden mit resonanten Wellenleitergittern^5,6. Die Kennzeichnung der Zellen ist bei diesen Ansätzen experimentell nicht erforderlich. Da diese physikalischen Auslesungen mit Signalen mit geringer Amplitude betrieben werden, gelten solche Methoden als nicht-invasiv, sie ermöglichen eine kontinuierliche Zellüberwachung potenziell in Echtzeit und die Beobachtungszeit wird nur durch die Zellkultur und nicht durch das Auslesen begrenzt. Ähnlich wie aus ganzen Organen berichten labelfreie Ansätze häufig über ganzheitliche Zellreaktionen, weit nach der Rezeptoraktivierung, wenn die Integration entlang des gesamten Signalnetzes zu zeitabhängigen, aber eher unspezifischen Veränderungen in der Zellmorphologie oder Massenumverteilung führt. Während impedanzbasierte Assays die dielektrische Signatur von Veränderungen in der Zellform^7,8messen, sind Messungen mit resonanzförmigen Wellenleitergittern empfindlich gegenüber Veränderungen des Brechungsindexes an der Zellsubstratschnittstelle, die sich aus der dynamischen Massenumverteilung (DMR)⁹ergeben. Der integrative Charakter macht etikettenfreie Methoden extrem empfindlich gegenüber Rezeptor-vermittelten Ereignissen, unabhängig von der Art(n) des G-Proteins (G_q, G_i/0, G_s, G_12/13) oder ‘-arrestin, die an der Signalkaskade⁶ beteiligt sind und sich gut für endogene Expressionsniveaus des Rezeptors eignen.

In einem standardlabelfreien Impedanz-basierten Assay werden die Zellen in Multi-Well-Platten mit koplanaren Goldfilmelektroden, die auf der Unterseite jedes Brunnens abgelagert^{sind, 10}anwachsen. Diese Elektroden-Arrays sind mit einem Impedanzanalysator verbunden und die Zellreaktionen auf einen experimentellen Reiz werden aus einzelnen Brunnen durch zeitaufgelöste Impedanzmessungen aufgezeichnet. In einem typischen GPCR-Test wird jedem einzelnen Brunnen ein Ligand in individuell unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Die Liganden-induzierten Veränderungen im Impedanz-Zeitverlauf werden dann in Bezug auf Merkmalskurvenmerkmale wie maximale Signaländerung, Fläche unter der Kurve, Signaländerung innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls oder Steigung der Kurve zu einem bestimmten Zeitpunkt analysiert, um die Wirksamkeit und Wirksamkeit des Liganden zu quantifizieren¹¹.

Die Kosten für die Elektroden-Arrays können die Anwendung dieser Technik in HTS-Kampagnen (High Throughput Screening) einschränken. Darüber hinaus steigt die Anzahl der Einzelmessungen mit zunehmender Anzahl parallel zu befolgender Proben und reduziert damit die verfügbare Zeitauflösung für jeden Brunnen schrittweise – auch bei modernsten Mehrkanalaufnahmen. Unter solchen Bedingungen können schnelle und vorübergehende Zellreaktionen der Messung entgehen. Darüber hinaus setzt der konventionelle Brunnen – ein Konzentrationsansatz einen signifikanten Zeit- und Kostenfaktor für durchfundierte Organ-on-Chip- oder Body-on-Chip-Entwicklungen in Bezug auf ihre Eignung in der Liganden-GPCR-Interaktionsanalyse.

Aus diesem Grund haben wir ein stufenweises Dosierungsprotokoll entwickelt, das die Aufzeichnung von Volldosis-Wirkungskurven der Liganden-induzierten GPCR-Aktivierung in kultivierten Zellmonolayern ermöglicht, indem die Impedanz eines einzelnen Brunnens kontinuierlich überwacht wird, während die Agonistenkonzentration schrittweise erhöht wird. Das serielle Agonistenadditionsprotokoll erhöht den Durchsatz pro Brunnen signifikant von einer Konzentration auf 10 oder mehr Konzentrationen, wie am aktuellen Beispiel menschlicher U-373-MG-Zellen gezeigt wird, die den Histamin-1-Rezeptor (H1R) endogen ausdrücken. Somit hat die Methode das Potenzial, den Durchsatz in etikettenfreien Dosis-Wirkungs-Studien deutlich zu verbessern, während die Zeitauflösung am instrumentellen Maximum beibehalten wird.