Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos

Este relatório apresenta uma descrição detalhada de um protocolo de adição serial desenvolvido para a quantificação da ativação do receptor acoplado por proteínaG induzida por ligand (GPCR) em células cultivadas aderentamente por medições de impedância sem rótulo. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) estão envolvidos em uma infinidade de funções fisiológicas e doenças humanas¹. Por causa disso e sua boa acessibilidade na superfície celular, os GPCRs são um dos alvos mais importantes de drogas. Esta avaliação se reflete em um número estimado de ~700 medicamentos aprovados visando GPCRs, equivalente a uma participação de ~35% em todas as drogas comercializadas².

O desenvolvimento de novas drogas compreende dois processos centrais: (i) a identificação e caracterização funcional de moléculas-alvo biológicas, e (ii) a descoberta de novas substâncias de chumbo e seu desenvolvimento em drogas administradas. Em ambos os processos, métodos eficientes são necessários para avaliar quantitativamente as interações medicamentosas-alvo e a resposta biológica subsequente a jusante. Diferentes estágios do processo pré-clínico de desenvolvimento de medicamentos fazem uso de diferentes métodos de análise que vão desde estudos de interação biomolecular entre medicamentos e alvos, além de estudos funcionais sobre células na cultura, até experimentos sobre material de órgãos excizados ou animais inteiros. Tanto, a significância fisiológica quanto a complexidade biológica aumentam do primeiro para o último³. Embora seja o objetivo global de minimizar os experimentos com animais, estudos farmacológicos usando órgãos isolados de animais de laboratório ou mesmo animais inteiros são considerados inevitáveis para caracterizar de forma abrangente novos candidatos a medicamentos. Em termos de leitura analítica, estudos de farmacologia de órgãos fornecem uma resposta funcional distal e integrativa “holística” de maior relevância fisiológica. Uma desvantagem desses experimentos é que eles não são compatíveis com triagem de alto desempenho por razões técnicas e éticas e foram amplamente substituídos por estudos baseados na cultura celular in vitro⁴.

Métodos para quantificar a ativação do GPCR nas culturas celulares incluem diferentes ensaios químicos baseados em rótulos, que detectam especificamente segundo mensageiros, estado de fosforilação de proteínas de sinalização a jusante, ativação transcricional através de certos fatores de transcrição ou tráfico de receptor intracelular induzido por ligand^4,5. Uma desvantagem desses ensaios baseados em rótulos é a necessidade de rotular as células com corantes potencialmente prejudiciais ou marcadores radioativos. Isso muitas vezes requer executar o ensaio como uma determinação de ponto final para um tempo de exposição que tem que ser especificado um priori. O uso de ensaios de ponto final baseados em rótulos sofre desse timing muito limitado e tendencioso do experimento e do risco de que rótulos químicos e sondas possam interferir na fisiologia celular regular – potencialmente despercebida pelo experimentador.

Nos últimos anos, ensaios sem rótulos para monitoramento da ativação do GPCR surgiram, como técnicas baseadas em impedância ou métodos ópticos que aplicam grades ressonantes de guia de onda^5,6. A rotulagem das células não é experimentalmente necessária com essas abordagens. Como essas leituras físicas operam em sinais de baixa amplitude, tais métodos são considerados não invasivos, permitem o monitoramento contínuo celular potencialmente em tempo real e o tempo de observação é limitado apenas pela cultura celular não pela leitura. Semelhante às leituras de órgãos inteiros, abordagens sem rótulos comumente relatam respostas de células holísticas, muito a jusante da ativação do receptor quando a integração ao longo de toda a rede de sinalização leva a mudanças dependentes do tempo, mas sim inespecíficas na morfologia celular ou redistribuição em massa. Considerando que ensaios baseados em impeção medem a assinatura dielétrica de mudanças na forma celular^7,8, as medidas usando grades ressonantes de guia de onda são sensíveis a alterações no índice refrativo na interface do substrato celular decorrentes da redistribuição dinâmica de massa (DMR)⁹. O caractere integrativo torna os métodos livres de rótulos extremamente sensíveis aos eventos mediados por receptores, independentemente do tipo(s) de proteína G (G_q , G_i/0, G_12/13) ou β-arrestin envolvido na cascata de sinalização 6 e adequado para níveis endógenos de expressão do receptor.

Em um ensaio baseado em impedância sem rótulo padrão, as células são cultivadas em placas multi-bem com eletrodos de filme de ouro coplanar depositados na parte inferior de cada poço¹⁰. Essas matrizes de eletrodos estão conectadas a um analisador de impedância e as respostas das células a um estímulo experimental são registradas a partir de poços individuais por leituras de impedância resolvidas pelo tempo. Em um ensaio típico gpcr um ligand é adicionado em concentrações individualmente diferentes para cada bem individual. As alterações induzidas no curso de tempo de impedância são então analisadas em relação a características de curva característica, como mudança máxima de sinal, área a curva, mudança de sinal dentro de um determinado intervalo de tempo ou inclinação da curva em um ponto de tempo especificado, a fim de quantificar a potência e eficácia do ligand¹¹.

O custo das matrizes de eletrodos pode limitar a aplicação dessa técnica em campanhas de triagem de alto nível (HTS). Além disso, com o aumento do número de amostras a serem seguidas em paralelo, o número de medições individuais aumenta e, assim, reduz a resolução de tempo disponível para cada poço gradualmente – mesmo para gravações multicanais de última geração. Nessas condições, respostas rápidas e transitórias das células podem escapar da medição. Além disso, o convencional bem – uma abordagem de concentração impõe um fator de tempo e custo significativo sem recursos perfundidos em desenvolvimentos de órgãos-on-chip ou body-on-chip em relação à sua adequação na análise de interação ligand-GPCR.

Por essa razão, desenvolvemos um protocolo de dosagem stepwise que permite a gravação de curvas completas de resposta de dose da ativação gpcr induzida por ligand em monocamadas de células cultivadas, monitorando continuamente a impeância de um único poço enquanto a concentração agonista é aumentada stepwise. O protocolo de adição agonista em série aumenta significativamente o throughput por poço de uma concentração para 10 ou mais concentrações, como mostrado no exemplo atual das células U-373 MG humanas, que expressam endógenamente o receptor histamina 1 (H1R). Assim, o método tem o potencial de melhorar significativamente o throughput em estudos de dose-resposta sem rótulos, enquanto a resolução de tempo é mantida no máximo instrumental.