Protocollo di dosing stepwise per aumentare la velocità effettiva nei dati GPCR basati su impeditto per etichetta

Questo rapporto presenta una descrizione dettagliata di un protocollo di addizione seriale sviluppato per la quantificazione dell’attivazione del recettore accoppiato con proteina G (GPCR) indotta dal ligando (GPCR) nelle cellule coltivate con aderenza mediante misurazioni di impedimento senza etichette. I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono coinvolti in una moltitudine di funzioni fisiologiche e malattie umane¹. A causa di questo e della loro buona accessibilità sulla superficie cellulare, i GPCR sono uno dei più importanti bersagli farmacologici. Questa valutazione si riflette in un numero stimato di 700 dollari di farmaci approvati destinati ai GPCR, pari a una quota del 35% su tutti i farmaci commercializzati².

Lo sviluppo di nuovi farmaci comprende due processi centrali: (i) l’identificazione e la caratterizzazione funzionale delle molecole bersaglio biologiche e (ii) la scoperta di nuove sostanze di piombo e il loro sviluppo in farmaci amministrativi. In entrambi i processi, sono necessari metodi efficienti per valutare quantitativamente le interazioni farmaco-bersaglio e la successiva risposta biologica a valle. Diverse fasi del processo di sviluppo di farmaci preclinici fanno uso di diversi metodi di analisi che vanno da studi di interazione biomolecolare tra farmaco e bersaglio, su studi funzionali sulle cellule in coltura, a esperimenti su materiale di organi ascisi o animali interi. Entrambi, il significato fisiologico e la complessità biologica aumentano dal primo al secondo³. Sebbene sia l’obiettivo generale di ridurre al minimo gli esperimenti sugli animali, gli studi farmacologici che utilizzano organi isolati di animali da laboratorio o persino animali interi sono considerati inevitabili per caratterizzare in modo completo nuovi farmaci candidati. In termini di lettura analitica, gli studi di farmacologia degli organi forniscono una risposta funzionale “olistica” dissintesa e integrativa di massima rilevanza fisiologica. Uno svantaggio di tali esperimenti è che non sono compatibili con lo screening ad alta produttività per motivi tecnici ed etici e sono stati in gran parte sostituiti da studi basati sulla coltura delle cellule in vitro⁴.

I metodi per quantificare l’attivazione di GPCR nelle colture cellulari includono diversi saggi chimici basati su etichette, che rilevano specificamente i secondi messaggeri, lo stato di fosforolalazione delle proteine di segnalazione a valle, l’attivazione trascrizionale tramite determinati fattori di trascrizione o il traffico di recettori intracellulari indotti dal ligando^4,5. Uno degli inconvenienti di tali analisi basate su etichette è la necessità di etichettare le cellule con coloranti potenzialmente dannosi o marcatori radioattivi. Ciò richiede spesso l’esecuzione dell’espressione come endpoint-determinazione per un tempo di esposizione che deve essere specificato a priori. L’utilizzo di analisi endpoint basate su etichette soffre di questa tempistica molto limitata e di parte dell’esperimento e del rischio che etichette chimiche e sonde possano interferire con la fisiologia cellulare regolare – potenzialmente inosservata dallo sperimentatore.

Negli ultimi anni sono emersi saggi senza etichette per il monitoraggio dell’attivazione di GPCR, come tecniche basate su impedimento o metodi ottici che applicano griglie di guida d’onda risonanti^5,6. L’etichettatura delle cellule non è richiesta sperimentalmente con questi approcci. Poiché queste letture fisiche operano su segnali a bassa ampiezza, tali metodi sono considerati non invasivi, consentono un monitoraggio continuo delle cellule potenzialmente in tempo reale e il tempo di osservazione è limitato solo dalla coltura cellulare non dalla lettura. Simile alle letture da organi interi, gli approcci senza etichetta segnalano comunemente risposte olistiche cellulari, a valle dell’attivazione del recettore quando l’integrazione lungo l’intera rete di segnalazione porta a cambiamenti dipendenti dal tempo ma piuttosto non specifici nella morfologia cellulare o nella ridistribuzione di massa. Mentre i saggi basati su impedimenti misurano la firma dielettrica delle variazioni della forma cellulare^7,8, le misurazioni utilizzando griglie di guida d’onda risonanti sono sensibili ai cambiamenti nell’indice di rifrazione nell’interfaccia cellulare-substrate derivanti dalla ridistribuzione dinamica della massa (DMR)⁹. Il carattere integrativo rende i metodi privi di etichetta estremamente sensibili agli eventi mediati dal recettore indipendentemente dal tipo(s) di proteina G (G_q, G_i/0, G_s, G_12/13) o z-arrestin coinvolti nella cascata di segnalazione⁶ e adatti per i livelli di espressione endogeni del recettore.

In un saggio standard senza etichetta basato su impedance le cellule sono coltivate aderentemente in piastre multi-bene con elettrodi coplanari a pellicola d’oro depositati sul fondo di ogni pozzo¹⁰. Questi array di elettrodi sono collegati a un analizzatore di impedimenti e le risposte cellulari a uno stimolo sperimentale sono registrate da singoli pozzi da letture di impedimenti risolti nel tempo. In un tipico saggio GPCR un ligando viene aggiunto in concentrazioni singolarmente diverse ad ogni singolo pozzo. Le variazioni indotte dal ligando nel corso del tempo impedibile vengono quindi analizzate rispetto alle caratteristiche della curva come il cambio massimo del segnale, l’area sotto la curva, la variazione del segnale entro un determinato intervallo di tempo o pendenza della curva in un determinato punto temporale, al fine di quantificare la potenza e l’efficacia del ligando¹¹.

Il costo degli array di elettrodi può limitare l’applicazione di questa tecnica nelle campagne di screening ad alta produttività (HTS). Inoltre, con un numero crescente di campioni da seguire in parallelo, il numero di singole misurazioni aumenta e quindi riduce gradualmente la risoluzione del tempo disponibile per ogni pozzo , anche per le registrazioni multicanale all’avanguardia. In tali condizioni le risposte cellulari rapide e transitorie possono sfuggire alla misurazione. Inoltre, quello convenzionale bene – un approccio di concentrazione impone un fattore di tempo e di costo significativo sugli sviluppi perfusi organo su chip o corpo su chip per quanto riguarda la loro idoneità nell’analisi dell’interazione ligand-GPCR.

Per questo motivo, abbiamo sviluppato un protocollo di dosaggio stepwise che consente la registrazione di curve di risposta alla dose completa dell’attivazione GPCR indotta dal ligando in monostrati cellulari coltivati monitorando continuamente l’impedimento di un singolo pozzo mentre la concentrazione agonista aumenta di passo. Il protocollo di addizione agonista seriale aumenta significativamente la produttività per bene da una concentrazione a 10 o più concentrazioni, come mostrato nell’attuale esempio di cellule umane U-373 MG, che endogenamente esprimono il recettore dell’istamina 1 (H1R). Pertanto, il metodo ha il potenziale per migliorare significativamente la produttività negli studi di risposta alla dose senza etichette, mentre la risoluzione del tempo viene mantenuta al massimo strumentale.