بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات

يقدم هذا التقرير وصفاً مفصلاً لبروتوكول الإضافة التسلسلية الذي تم تطويره للقياس الكمي لتنشيط مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين (GPCR) التي يسببها ليغاند (GPCR) في الخلايا المزروعة بالارتباط بواسطة قياسات المعاوقة الخالية من التسمية. وتشارك مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs) في العديد من الوظائف الفسيولوجية والأمراض البشرية¹. وبسبب هذا وسهولة الوصول إليها على سطح الخلية ، GPCRs هي واحدة من أهم أهداف المخدرات. وينعكس هذا التقييم في عدد يقدر بنحو 700 دواء معتمد يستهدف الـ GPCRs، أي ما يعادل حصة تبلغ ~ 35٪ على جميع الأدوية المسوقة^2.

ويشمل استحداث عقاقير جديدة عمليتين رئيسيتين هما: ‘1’ تحديد الجزيئات البيولوجية المستهدفة وتوصيفها الوظيفي، و’2′ اكتشاف مواد الرصاص الجديدة وتطويرها لتصبح أدوية قابلة للإدارة. وفي كلتا العمليتين، يلزم استخدام أساليب فعالة لتقييم التفاعلات بين المخدِّرات والأهداف والاستجابة البيولوجية اللاحقة. مراحل مختلفة من عملية تطوير المخدرات قبل السريرية الاستفادة من أساليب مختلفة للتحليل تتراوح بين دراسات التفاعل الجزيئي الحيوي بين المخدرات والهدف، على الدراسات الوظيفية على الخلايا في الثقافة، إلى التجارب على مواد الأعضاء المستأصلة أو الحيوانات بأكملها. على حد سواء ، والأهمية الفسيولوجية والتعقيد البيولوجي زيادة من السابق إلى³الأخيرة. على الرغم من أن الهدف العام هو تقليل التجارب الحيوانية ، إلا أن الدراسات الدوائية باستخدام الأعضاء المعزولة من الحيوانات المختبرية أو حتى الحيوانات الكاملة تعتبر حتمية لتوصيف شامل للمرشحين الجدد للأدوية. من حيث القراءة التحليلية ، توفر دراسات علم أدوية الأعضاء استجابة وظيفية “شاملة” متكاملة ذات أهمية فسيولوجية أعلى. ومن عيوب هذه التجارب أنها لا تتوافق مع فحص الإنتاجية العالية لأسباب تقنية وأخلاقية، وقد تم استبدالها إلى حد كبير بدراسات تستند إلى ثقافة الخلية المختبرية^4.

طرق لقياس تنشيط GPCR في ثقافات الخلايا تشمل مختلف الاختبارات الكيميائية القائمة على التسمية، والتي تكشف على وجه التحديد الرسل الثانية، وحالة الفوسفور من البروتينات الإشارات المصب، وتفعيل النسخ عبر عوامل النسخ معينة أو ligand الناجمة عن الاتجار مستقبلات داخل الخلايا^4،5. ومن عيوب هذه المقالات المستندة إلى التسميات ضرورة تسمية الخلايا بأصباغ أو علامات مشعة قد تكون ضارة. وهذا غالباً ما يتطلب تشغيل المنقّأ كـ تحديد نقطة النهاية لوقت تعرض يجب أن يتم تحديده مسبقاً. إن استخدام اختبارات نقطة النهاية المستندة إلى التسميات يعاني من هذا التوقيت المحدود والمتحيز للغاية للتجربة وخطر أن التسميات الكيميائية والمسابير قد تتداخل مع فسيولوجيا الخلايا العادية – التي قد لا يلاحظها المجرب.

في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقالات خالية من التسمية لرصد تنشيط GPCR ، مثل التقنيات القائمة على المعاوقة أو الأساليب البصرية التي تطبق صريف اتصال الرنانة^5،6. ولا يشترط وضع علامات على الخلايا من الناحية التجريبية في هذه النُهج. كما هذه القراءة المادية تعمل على إشارات السعة المنخفضة، وتعتبر هذه الأساليب غير الغازية، فإنها تسمح للرصد المستمر الخلية يحتمل في الوقت الحقيقي ووقت المراقبة محدودة فقط من قبل ثقافة الخلية وليس من قبل القراءة. على غرار عمليات القراءة من أجهزة كاملة ، وعادة ما يقدم نهج خالية من التسمية على استجابات الخلايا الشاملة ، بعيدا المصب من تنشيط مستقبلات عندما التكامل على طول شبكة الإشارات بأكملها يؤدي إلى تغييرات تعتمد على الوقت ولكن بدلا غير محددة في مورفولوجيا الخلية أو إعادة توزيع الشامل. في حين أن الاختبارات المستندة إلى المعاوقة تقيس التوقيع العازل للتغيرات في شكل الخلية^7،8، فإن القياسات التي تستخدم صريفات الموجات الرنانة حساسة للتغيرات في مؤشر الانكسار في واجهة الركيزة الخلوية الناشئة عن إعادة توزيع الكتلة الديناميكية (DMR)⁹. الطابع التكاملي يجعل أساليب خالية من التسمية حساسة للغاية للأحداث بوساطة مستقبلات بغض النظر عن نوع (ق) من البروتين G (G_س،G_i/0،G_s،G_12/13)أو α-arrestin المشاركة في سلسلة الإشارات⁶ ومناسبة تماما لمستويات التعبير الذاتية من المستقبلات.

في معيار المعاوقة خالية من المعاوقة على أساس المعاوقة نمت الخلايا في لوحات متعددة الآبار مع أقطاب coplanar الذهب فيلم المودعة في الجزء السفلي من كل بئر¹⁰. وترتبط هذه الصفائف القطب إلى محلل المعاوقة ويتم تسجيل استجابات الخلية إلى التحفيز التجريبي من الآبار الفردية عن طريق قراءات المعاوقة حل الوقت. في مقاضد GPCR نموذجي يتم إضافة ligand في تركيزات مختلفة بشكل فردي لكل فرد بشكل جيد. ثم يتم تحليل التغييرات الناجمة عن ligand في مسار وقت المعاوقة فيما يتعلق بميزات المنحنى المميزة مثل الحد الأقصى لتغيير الإشارة ، والمساحة تحت المنحنى ، وتغيير الإشارة في غضون فترة زمنية معينة أو ميل المنحنى في نقطة زمنية محددة ، من أجل تحديد فعالية وفعالية ligand^11.

قد تحد تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية من تطبيق هذه التقنية في حملات الفحص عالي الإنتاجية (HTS). وعلاوة على ذلك ، مع تزايد أعداد العينات التي يتعين اتباعها بالتوازي ، يزيد عدد القياسات الفردية وبالتالي يقلل من دقة الوقت المتاحة لكل بئر تدريجيا – حتى بالنسبة للتسجيلات المتعددة القنوات. في ظل هذه الظروف قد الاستجابات الخلية سريعة وعابرة الهروب من القياس. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد الأساليب التقليدية – نهج تركيز واحد يفرض عامل وقت وتكلفة كبير على التطورات المُطَلَّبة على الأجزاء أو الأجزاء على الشريحة فيما يتعلق بملاءمتها في تحليل تفاعل ligand-GPCR.

لهذا السبب، وضعنا بروتوكول الجرعات خطوة خطوة خطوة التي تمكن من تسجيل منحنيات الاستجابة الجرعة الكاملة من تنشيط GPCR الناجم عن ligand في أحادية الخلية المستزرعة عن طريق الرصد المستمر لمعاوقة بئر واحد في حين يتم زيادة تركيز ناهدي خطوة بخطوة. يزيد بروتوكول الإضافة المغطورية التسلسلي بشكل كبير من الإنتاجية لكل بئر من تركيز واحد إلى 10 تركيزات أو أكثر ، كما هو موضح في المثال الحالي لخلايا U-373 MG البشرية ، والتي تعبر بشكل داخلي عن مستقبلات الهيستامين 1 (H1R). وبالتالي، فإن الأسلوب لديه القدرة على تحسين الإنتاجية بشكل كبير في دراسات الاستجابة للجرعة الخالية من التسمية، في حين يتم الاحتفاظ بالدقة الزمنية في الحد الأقصى الفعال.