Un nuovo toolkit per la valutazione delle funzioni geniche utilizzando la stabilizzazione condizionale Cas9
Summary
Qui, descriviamo uno strumento di modifica del genoma basato sulla stabilizzazione temporale e condizionale della proteina 9 (Cas9) associata a ripetizione palindromica corta (CRISPR)(Cas9) raggruppata regolarmente intervallata sotto la piccola molecola, Shield-1. Il metodo può essere utilizzato per cellule in coltura e modelli animali.
Abstract
La tecnologia clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associata alla proteina 9 (CRISPR/Cas9) è diventata uno strumento di laboratorio prevalente per introdurre modifiche accurate e mirate nel genoma. La sua enorme popolarità e la rapida diffusione sono attribuite alla sua facilità d’uso e precisione rispetto ai suoi predecessori. Tuttavia, l’attivazione costitutiva del sistema ha applicazioni limitate. In questo articolo, descriviamo un nuovo metodo che consente il controllo temporale dell’attività CRISPR / Cas9 basato sulla stabilizzazione condizionale della proteina Cas9. La fusione di un mutante ingegnerizzato della proteina legante la rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) consente la rapida degradazione di Cas9 che a sua volta può essere stabilizzata dalla presenza di un ligando sintetico FKBP12 (Shield-1). A differenza di altri metodi inducibili, questo sistema può essere adattato facilmente per generare sistemi bi-cistronici per co-esprimere DD-Cas9 con un altro gene di interesse, senza regolazione condizionale del secondo gene. Questo metodo consente la generazione di sistemi tracciabili e la manipolazione parallela e indipendente degli alleli presi di mira dalla nucleasi Cas9. La piattaforma di questo metodo può essere utilizzata per l’identificazione sistematica e la caratterizzazione di geni essenziali e l’interrogazione delle interazioni funzionali dei geni in contesti in vitro e in vivo.
Introduction
CRISPR-Cas9 che sta per“clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9”è stato scoperto per la prima volta come parte di studi sull’immunità adattativa batterica1,2. Oggi, CRISPR / Cas9 è diventato lo strumento più riconosciuto per l’editing genetico programmabile e sono state sviluppate diverse iterazioni del sistema per consentire modulazioni trascrizionali ed epigenetiche3. Questa tecnologia consente la manipolazione genetica altamente precisa di quasi tutte le sequenze di DNA4.
I componenti essenziali di qualsiasi editing genetico CRISPR sono una sequenza di RNA guida personalizzabile e la nucleasi Cas95. La guida dell’RNA si lega alla sequenza bersaglio-complementare nel DNA, dirigendo la nucleasi Cas9 per eseguire una rottura a doppio filamento in un punto specifico del genoma3,4. Il sito di scissione risultante viene quindi riparato mediante end-joining non omologo (NHEJ) o riparazione diretta dall’omologia (HDR), con la conseguente introduzione di cambiamenti nella sequenza di DNA mirata5.
L’editing genetico basato su CRISPR / Cas9 è facile da usare e relativamente economico rispetto alle precedenti tecniche di modifica genetica e ha dimostrato di essere sia efficiente che robusto in una molteplicità di sistemi2,4,5. Tuttavia, il sistema presenta alcune limitazioni. L’espressione costitutiva di Cas9 ha spesso dimostrato di provocare un aumento del numero di off-target e un’elevata tossicità cellulare4,6,7,8. Inoltre, il targeting costitutivo di geni essenziali e di sopravvivenza cellulare da parte di Cas9 toglie la sua capacità di eseguire alcuni tipi di studi funzionali come gli studi cinetici sulla morte cellulare7.
Diversi strumenti CRISPR-Cas9 inducibili o controllati condizionatamente sono stati sviluppati per risolvere questi problemi6, come Tet-ON e Tet-Off9; ricombinazione sito-specifica10; prossimità indotta chimicamente11; giunzione dipendente dall’inteina3; e sistemi di localizzazione nucleare basati sul recettore degli estrogeni 4-idrossitamoxifene (ER)12. In generale, la maggior parte di queste procedure (intein splicing e sistemi di proximity split indotti chimicamente) non offrono un controllo reversibile, presentano una risposta cinetica molto lenta al trattamento farmacologico (sistema Tet-On/Off) o non sono suscettibili di manipolazione ad alto rendimento6.
Per affrontare queste limitazioni abbiamo sviluppato un nuovo toolkit che non solo fornisce un editing genetico rapido e robusto controllato nel tempo, ma garantisce anche tracciabilità, sintonizzazione e suscettibilità alla manipolazione genica ad alto rendimento. Questa nuova tecnologia può essere utilizzata in linee cellulari, organoidi e modelli animali. Il nostro sistema si basa su un dominio ingegnerizzato, quando fuso a Cas9, induce il suo rapido degrado. Tuttavia, può essere rapidamente stabilizzato con una piccola molecola altamente selettiva, non tossica e permeabile alle cellule. Più specificamente, abbiamo progettato il “dominio destabilizzante” (DD) mutante umano FKBP12 in Cas9, contrassegnando Cas9 per una degradazione rapida e costitutiva attraverso il sistema ubiquitina-proteasoma quando espresso in cellule di mammifero13. Il ligando sintetico DD, Shield-1 può stabilizzare la conformazione DD, impedendo così la degradazione delle proteine fuse a DD (come Cas9) in modo molto efficiente e con una risposta cinetica veloce14,15. Da notare, Shield-1 si lega con tre ordini di grandezza più stretto al mutante FKBP12 che alla sua controparte wild-type14.
La coppia DD-Cas9/Shield-1 può essere utilizzata per studiare l’identificazione sistematica e la caratterizzazione di geni essenziali in cellule in coltura e modelli animali come abbiamo precedentemente dimostrato prendendo di mira condizionatamente il gene CypD, che svolge un ruolo importante nel metabolismo dei mitocondri; EGFR, un attore chiave nella trasformazione oncogenica; e Tp53, un gene centrale nella risposta al danno al DNA. Oltre all’editing genetico controllato temporalmente e condizionatamente, un altro vantaggio del metodo è che la stabilizzazione di DD-Cas9 è indipendente dalla sua trascrizione. Questa caratteristica consente la co-espressione, sotto lo stesso promotore, di marcatori tracciabili e ricombinasi, come la ricombinasi dipendente dal recettore degli estrogeni, CREER. In questo lavoro, mostriamo come il nostro metodo può essere utilizzato con successo in vitro, per colpire condizionatamente, ad esempio, il gene di replicazione del DNA, RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la capacità di interrogare funzionalmente i genomi2. Tuttavia, l’inattivazione dei geni spesso si traduce in letalità cellulare, deficit funzionali e difetti dello sviluppo, limitando l’utilità di tali approcci per lo studio delle funzionigeniche 7. Inoltre, l’espressione costitutiva di Cas9 può provocare tossicità e la generazione di effetti fuori bersaglio6. Sono stati sviluppati diversi approcci per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i precedenti membri del nostro laboratorio e lo scienziato Serif Senturk per il lavoro precedente. Ringraziamo Danilo Segovia per aver letto criticamente questo manoscritto. Questo studio è stato possibile e supportato da Swim Across America e dal programma Cancer Target Discovery and Development Center del National Cancer Institute.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
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