Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti
Summary
Burada, shield-1 adlı küçük molekül altında düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9’un (Cas9) zamansal ve koşullu stabilizasyonuna dayanan bir genom düzenleme aracı tarif ediyoruz. Yöntem kültürlü hücreler ve hayvan modelleri için kullanılabilir.
Abstract
Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9) teknolojisi, genomda doğru ve hedefli modifikasyonlar yapmak için yaygın bir laboratuvar aracı haline gelmiştir. Muazzam popülaritesi ve hızlı yayılımı, öncekilere kıyasla kolay kullanımına ve doğruluğuna atfedilmektedir. Ancak, sistemin constitutive aktivasyonu sınırlı uygulamalara sahiptir. Bu yazıda, CAS9 proteininin koşullu stabilizasyonuna dayalı CRISPR/Cas9 aktivitesinin zamansal kontrolüne izin veren yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Rapamycin bağlayıcı protein FKBP12’nin mühendislikteki bir mutantını Cas9’a (DD-Cas9) eritmek, Cas9’un hızlı bir şekilde bozulmasını sağlar ve bu da bir FKBP12 sentetik ligandının (Shield-1) varlığıyla stabilize edilebilir. Diğer indüklenebilir yöntemlerin aksine, bu sistem, ikinci genin koşullu düzenlenmesi olmadan, DD-Cas9’u başka bir ilgi geni ile birlikte ifade etmek için bi-cistronic sistemler üretmek için kolayca uyarlanabilir. Bu yöntem, izlenebilir sistemlerin üretilmesinin yanı sıra Cas9 çekirdeği tarafından hedeflenen alellerin paralel, bağımsız manipülasyonunu sağlar. Bu yöntemin platformu, temel genlerin sistematik olarak tanımlanması ve karakterizasyonu ve in vitro ve in vivo ortamlarda genlerin fonksiyonel etkileşimlerinin sorgulanması için kullanılabilir.
Introduction
“Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlarla ilişkili protein 9” anlamına gelen CRISPR-Cas9 ilk olarak bakteri adaptif bağışıklık 1,2üzerine yapılan çalışmaların bir parçası olarak keşfedilmiştir. Bugün CRISPR/Cas9 programlanabilir gen düzenleme için en tanınmış araç haline gelmiştir ve transkripsiyonel ve epigenetik modülasyonlara izin vermek için sistemin farklı yinelemeleri geliştirilmiştir3. Bu teknoloji, DNA4’ünhemen hemen her dizisinin son derece hassas genetik manipülasyonu sağlar.
Herhangi bir CRISPR gen düzenlemesinin temel bileşenleri özelleştirilebilir bir kılavuz RNA dizisi ve Cas9 çekirdeği5’tir. RNA kılavuzu, DNA’daki hedef tamamlayıcı diziye bağlanır ve Cas9 çekirdeğini genom3,4’tebelirli bir noktada çift iplikçik kırılması gerçekleştirmeye yönlendirir. Elde edilen bölünme bölgesi daha sonra homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) ile onarılır ve bunun sonucunda hedeflenen DNA dizisi5’tekideğişikliklerin tanıtılması .
CRISPR/Cas9 tabanlı gen düzenlemenin kullanımı kolaydır ve önceki gen düzenleme tekniklerine kıyasla nispeten ucuzdurve2,4,5sistemlerinin çokluğunda hem verimli hem de sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Yine de, sistem bazı sınırlamalar sunar. Cas9’un constitutive ifadesinin genellikle hedef dışı sayısı ve yüksek hücre toksisitesi4, 6,7,8ile sonuç olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, temel ve hücre sağkalım genlerinin Cas9 tarafından eşgüdümlü olarak hedeflleştirilmesi, hücre ölümünün kinetik çalışmaları gibi belirli türde fonksiyonel çalışmaları yapma yeteneğinden uzaklaştırır7.
Tet-ON ve Tet-Off9gibi6sorunlarını gidermek için farklı indükleyici veya koşullu kontrollü CRISPR-Cas9 araçları geliştirilmiştir; bölgeye özgü rekombinasyon10; kimyasal nedenli yakınlık11; intein bağımlı birleştirme3; ve 4-Hidroksikomoxifen Östrojen Reseptörü (ER) bazlı nükleer lokalizasyon sistemleri12. Genel olarak, bu prosedürlerin çoğu (intein birleştirme ve kimyasal olarak indüklenen yakınlık bölme sistemleri) geri dönüşümlü kontrol sunmaz, ilaç tedavisine (Tet-On/Off sistemi) çok yavaş bir kinetik yanıt sunmaz veya yüksek verimli manipülasyona uygun değildir6.
Bu sınırlamaları gidermek için sadece hızlı ve sağlam zamansal kontrollü gen düzenleme sağlamakla kalmayıp aynı zamanda yüksek verimli gen manipülasyonu için izlenebilirlik, ayarlanabilirlik ve amenability sağlayan yeni bir araç seti geliştirdik. Bu yeni teknoloji hücre hatlarında, organoidlerde ve hayvan modellerinde kullanılabilir. Sistemimiz, Cas9 ile kaynaştığında, hızlı bozulmasına neden olan tasarlanmış bir etki alanına dayanmaktadır. Bununla birlikte, son derece seçici, toksik olmayan, hücre geçirgen küçük bir molekülle hızla stabilize edilebilir. Daha spesifik olarak, insan FKBP12 mutantını Cas9’a “istikrarsızlaştırıcı etki alanı” (DD) olarak tasarladık, memeli hücrelerinde ifade edildiğinde Cas9’u her yerde bulunan-proteazom sistemi aracılığıyla hızlı ve konsutif bozulma için işaretledik13. DD sentetik ligand, Shield-1 DD konformasyonunu stabilize edebilir, böylece DD’ye (Cas9 gibi) kaynaşmış proteinlerin çok verimli bir şekilde bozulmasını önleyebilir ve hızlı bir kinetik yanıt14,15. Not olarak, Shield-1 mutant FKBP12’ye vahşi tip muadilinden daha sıkı üç büyüklük sırasına bağlanır14.
DD-Cas9/Shield-1 çifti, mitokondri metabolizmasında önemli bir rol oynayan CypD genini koşullu olarak hedef alarak daha önce gösterdiğimiz gibi, kültürlü hücrelerde ve hayvan modellerinde temel genlerin sistematik olarak tanımlanmasını ve karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilir; EGFR, onkojenik dönüşümde önemli bir oyuncu; ve Tp53, DNA hasar tepkisinde merkezi bir gen. Zamansal ve şartlı kontrollü gen düzenlemeye ek olarak, yöntemin bir başka avantajı DD-Cas9’un stabilizasyonunun transkripsiyondan bağımsız olmasıdır. Bu özellik, aynı promotör altında, izlenebilir belirteçlerin yanı sıra östrojen reseptörüne bağımlı rekombinaz, CREERgibi rekombinazların birlikte ifadesini sağlar. Bu çalışmada, yöntemimizin tüp bebek olarak nasıl başarıyla kullanılabileceğini gösteriyoruz, örneğin DNA replikasyon geni RPA3’ü koşullu olarak hedeflemek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 teknolojisi, genomları işlevsel olarak sorgulama yeteneğinde devrim yaptı2. Bununla birlikte, genlerin inaktivasyonu genellikle hücre öldürücülüğü, fonksiyonel eksiklikler ve gelişimsel kusurlarla sonuçlanır ve gen fonksiyonlarını incelemek için bu tür yaklaşımların yararını sınırlar7. Ayrıca, Cas9’un kesin ifadesi toksisiteye ve hedef dışı etkilerin üretilmesine neden olabilir6. CRISPR-Cas9 tabanlı genom d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuvarımızın önceki üyelerine ve bilim insanı Serif Şentürk’e önceki çalışmalarından dolayı teşekkür ediyoruz. Danilo Segovia’ya bu makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma Swim Across America ve National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center programı tarafından mümkün ve desteklendi.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
