条件Cas9安定化を用いた遺伝子機能評価のための新しいツールキット
Summary
ここでは、低分子Shield-1の下で定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR-)関連タンパク質9(Cas9)の時間的および条件付き安定化に基づくゲノム編集ツールについて説明する。この方法は、培養細胞および動物モデルに使用することができる。
Abstract
クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR-)関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)技術は、ゲノムに正確で標的化された改変を導入するための一般的な実験室ツールとなっています。その巨大な人気と急速な普及は、その前任者に比べてその使いやすさと精度に起因しています。しかし、システムの構成的な活性化は限られた用途を有する。本論文ではCas9タンパク質の条件安定化に基づくCRISPR/Cas9活性の時間的制御を可能にする新しい方法について述べた。ラパマイシン結合タンパク質FKBP12の操作された変異体をCas9(DD-Cas9)に融合させることで、FKBP12合成リガンド(Shield-1)の存在により安定させることができるCas9の急速な分解が可能になります。他の誘導可能な方法とは異なり、このシステムは、第2の遺伝子の条件付き調節なしに、関心のある別の遺伝子とDD-Cas9を共発現させるバイシストロニック系を生成するように容易に適応することができる。この方法は、追跡可能なシステムの生成だけでなく、Cas9ヌクレアーゼによって標的とされる対立遺伝子の平行、独立した操作を可能にする。この方法のプラットフォームは、必須遺伝子の系統的同定と特徴付け、およびin vitroおよびin vivo設定における遺伝子の機能的相互作用の尋問に使用することができる。
Introduction
CRISPR-Cas9は、定期的に間隔をあけられた短いパリンドローム反復関連タンパク質9″を表すCRISPR-Cas9は、細菌適応免疫1,2に関する研究の一環として初めて発見された。今日、CRISPR/Cas9はプログラム可能な遺伝子編集のための最も認識されたツールとなっており、システムの異なる反復は、転写およびエピジェネティックな変調を可能にするために開発されています3.この技術は、DNA4のほぼすべての配列の非常に正確な遺伝子操作を可能にする。
CRISPR遺伝子編集の必須コンポーネントは、カスタマイズ可能なガイドRNA配列とCas9ヌクレアーゼ5です。RNAガイドはDNA中の標的相補配列に結合し、Cas9ヌクレアーゼをゲノム3,4の特定の時点で二本鎖破断を行うように指示する。得られた切断部位は、次いで非相同性エンド結合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)によって修復され、その結果、標的DNA配列5に変化が導入された。
CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集は使いやすく、以前の遺伝子編集技術に比べて比較的安価であり、システム2、4、5の多重度において効率的かつ堅牢であることが証明されている。しかし、システムはいくつかの制限を提示します。Cas9の構成的な表現は、しばしばオフターゲットの増加数と高い細胞毒性4、6、7、8をもたらすことが示されている。さらに、Cas9による必須および細胞生存遺伝子の構成的標的化は、細胞死の運動学的研究のような特定のタイプの機能研究を行う能力を奪う7。
これらの問題に対処するために、Tet-ON や Tet-OFF9など、さまざまな誘導可能なまたは条件付きで制御された CRISPR-Cas9 ツールが開発されています。部位特異的組換え10;化学的に誘発された近接性11;インテイン依存スプライシング3;4-ヒドロキシタモキシフェンエストロゲン受容体(ER)ベース核局在化システム12.一般に、これらの手順の大部分(インテインスプライシングおよび化学的に誘発された近接分割システム)は、可逆的な制御を提供せず、薬物治療に対する非常に遅い運動応答(Tet-On/Offシステム)を提示するか、またはハイスループット操作6に適していない。
これらの制限に対処するために、我々は、高速かつ堅牢な時間制御遺伝子編集を提供するだけでなく、高スループット遺伝子操作にトレーサビリティ、タンナビリティ、無時性を保証する新しいツールキットを開発しました。この新しい技術は、細胞株、オルガノイド、および動物モデルに使用することができます。私たちのシステムは、Cas9に融合すると、その急速な劣化を誘発する、工学的ドメインに基づいています。しかし、非常に選択的で非毒性の細胞透過性の低分子で急速に安定化することができます。より具体的には、ヒトFKBP12変異体「不安定化ドメイン」(DD)をCas9に設計し、哺乳動物細胞13で発現したユビキチン・プロテアソーム系を介して迅速かつ構成的な分解を行うためにCas9をマーキングした。DD合成リガンドは、Shield-1がDD立体構造を安定化させることができ、非常に効率的な方法でDD(Cas9など)に融合したタンパク質の分解を防ぎ、かつ速い運動応答14,15を有する。注目に、Shield-1は、その野生型の対応する14よりも突然変異FKBP12に3桁の重さで結合します。
DD-Cas9/Shield-1ペアは、ミトコンドリアの代謝に重要な役割を果たすCypD遺伝子を条件付きで標的化することによって、培養細胞および動物モデルにおける必須遺伝子の体系的同定と特徴付けを研究するために使用することができます。EGFR、発癌性転換の主要プレーヤー;そしてTp53、DNA損傷応答の中心遺伝子。一時的および条件付きの遺伝子編集に加えて、この方法のもう一つの利点は、DD-Cas9の安定化がその転写に依存しない点である。この機能は、同じプロモーターの下で、エストロゲン受容体依存リコンビナーゼ、CREERなどのリコンビナーゼと同様に追跡可能なマーカーの共発現を可能にする。本研究では、DNA複製遺伝子、RPA3などの条件付きで標的化するために、インビトロで我々の方法をうまく使用する方法を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9技術は、機能的にゲノム2を尋問する能力に革命を起こしました。しかし、遺伝子の不活性化は、しばしば細胞の致死性、機能的欠陥、および発生欠陥をもたらし、遺伝子機能を研究するためのそのようなアプローチの有用性を制限する7。さらに、Cas9の構成的な表現は、毒性およびオフターゲット効果6の生成をもたらす可能性が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの研究室の以前のメンバーと科学者のセリフ・セントゥルクに前の研究に感謝します。この原稿を批判的に読んでくださったダニーロ・セゴビアに感謝します。この研究は、スイム・アクロス・アメリカと国立がん研究所がんターゲット発見開発センタープログラムによって可能であり、支援されました。
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
