Um novo kit de ferramentas para avaliar funções genéticas usando estabilização condicional cas9
Summary
Aqui, descrevemos uma ferramenta de edição de genomas baseada na estabilização temporal e condicional da re repetição palindômica curta interespaçada regularmente interespaçada ( CRISPR-) (Cas9) sob a pequena molécula, Shield-1. O método pode ser usado para células cultivadas e modelos animais.
Abstract
A tecnologia de retecção palindômica curta interespaçada (CRISPR-) (CRISPR-) se tornou uma ferramenta de laboratório predominante para introduzir modificações precisas e direcionadas no genoma. Sua enorme popularidade e rápida disseminação são atribuídas ao seu fácil uso e precisão em comparação com seus antecessores. No entanto, a ativação constitutiva do sistema tem aplicações limitadas. Neste artigo, descrevemos um novo método que permite o controle temporal da atividade CRISPR/Cas9 com base na estabilização condicional da proteína Cas9. Fundir um mutante projetado da proteína de ligação de rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) permite a rápida degradação do Cas9 que, por sua vez, pode ser estabilizado pela presença de um ligante sintético FKBP12 (Shield-1). Ao contrário de outros métodos induíveis, este sistema pode ser adaptado facilmente para gerar sistemas bi-cistronic para co-expressar DD-Cas9 com outro gene de interesse, sem regulação condicional do segundo gene. Este método permite a geração de sistemas rastreáveis, bem como a manipulação paralela e independente de alelos visados pela nuclease Cas9. A plataforma deste método pode ser utilizada para a identificação sistemática e caracterização de genes essenciais e o interrogatório das interações funcionais de genes em ambientes in vitro e in vivo.
Introduction
CRISPR-Cas9 que significa “agrupada regularmente interespaçada proteína palindômica associada a repetições 9” foi descoberta pela primeira vez como parte de estudos sobre imunidade adaptativa bacteriana1,2. Hoje, o CRISPR/Cas9 tornou-se a ferramenta mais reconhecida para edição de genes programáveis e diferentes iterações do sistema foram desenvolvidas para permitir modulações transcricionais e epigenéticas3. Esta tecnologia permite a manipulação genética altamente precisa de quase qualquer sequência de DNA4.
Os componentes essenciais de qualquer edição de genes CRISPR são uma sequência de RNA guia personalizável e a nuclease Cas95. O guia RNA se liga à sequência alvo-complementar no DNA, direcionando a nuclease Cas9 para realizar uma quebra de dois fios em um ponto específico no genoma3,4. O local de decote resultante é então reparado por nhej (nhej) ou reparo direcionado por esmologia (HDR), com a consequente introdução de alterações na sequência de DNA direcionada5.
A edição de genes baseada em CRISPR/Cas9 é fácil de usar e relativamente barata em comparação com técnicas anteriores de edição de genes e tem sido comprovadamente eficiente e robusta em uma multiplicidade de sistemas2,4,5. No entanto, o sistema apresenta algumas limitações. A expressão constitutiva de Cas9 tem sido frequentemente demonstrada como resultado de um aumento do número de fora dos alvos e alta toxicidade celular4,6,7,8. Além disso, o direcionamento constitutivo de genes essenciais e de sobrevivência celular por Cas9 tira sua capacidade de realizar certos tipos de estudos funcionais, como estudos cinéticos de morte celular7.
Diferentes ferramentas CRISPR-Cas9 controladas condicionalmente ou controladas condicionalmente foram desenvolvidas para resolver essas questões6, como Tet-ON e Tet-Off9; recombinação específica do local10; proximidade quimicamente induzida11; emenda dependente da inteínia3; e 4-Receptor de Estrogênio baseado em Hidroxitamoxifen (ER) sistemas de localização nuclear12. Em geral, a maioria desses procedimentos (splicing de intein e sistemas de divisão de proximidade quimicamente induzidos) não oferecem controle reversível, apresentam uma resposta cinética muito lenta ao tratamento medicamentoso (sistema Tet-On/Off), ou não são favoráveis à manipulação de alta produtividade6.
Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um novo kit de ferramentas que não só fornece edição de genes controlados temporais e rápidos, mas também garante rastreabilidade, sintonia e comodidade à manipulação de genes de alto throughput. Esta nova tecnologia pode ser usada em linhas celulares, organoides e modelos animais. Nosso sistema é baseado em um domínio projetado, quando fundido ao Cas9, induz sua rápida degradação. No entanto, pode ser rapidamente estabilizado com uma molécula pequena altamente seletiva, não tóxica e permeável celular. Mais especificamente, projetamos o mutante FKBP12 humano “domínio desestabilizador” (DD) para Cas9, marcando Cas9 para degradação rápida e constitutiva através do sistema ubiquitin-proteasome quando expresso em células mamíferas13. O ligante sintético DD, Shield-1 pode estabilizar a conformação DD, evitando assim a degradação de proteínas fundidas ao DD (como Cas9) de forma muito eficiente, e com uma resposta cinética rápida14,15. Note-se que o Shield-1 liga-se com três ordens de magnitude mais apertadas ao mutante FKBP12 do que à sua contraparte do tipo selvagem14.
O par DD-Cas9/Shield-1 pode ser usado para estudar a identificação sistemática e caracterização de genes essenciais em células cultivadas e modelos animais, como mostramos anteriormente mirando o gene CypD, que desempenha um papel importante no metabolismo das mitocôndrias; EGFR, um player-chave na transformação oncogênica; e Tp53, um gene central na resposta a danos de DNA. Além da edição de genes temporal e condicionalmente controlada, outra vantagem do método é que a estabilização do DD-Cas9 é independente de sua transcrição. Esse recurso permite a co-expressão, sob o mesmo promotor, de marcadores rastreáveis, bem como recombinases, como a recombinase dependente do receptor de estrogênio, CREER. Neste trabalho, mostramos como nosso método pode ser usado com sucesso in vitro, para atingir condicionalmente, por exemplo, o gene de replicação de DNA, RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a capacidade de interrogar funcionalmente genomas2. No entanto, a inativação de genes muitas vezes resulta em letalidade celular, déficits funcionais e defeitos de desenvolvimento, limitando a utilidade de tais abordagens para o estudo das funções genéticas7. Além disso, a expressão constitutiva do Cas9 pode resultar em toxicidade e na geração de efeitos fora do alvo6. Diferentes abordagens foram desenv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros anteriores do nosso laboratório e cientista Serif Senturk pelo trabalho anterior. Agradecemos a Danilo Segovia pela leitura crítica deste manuscrito. Este estudo foi possível e apoiado pela Swim Across America e pelo programa National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
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