مجموعة أدوات جديدة لتقييم وظائف الجينات باستخدام تثبيت Cas9 الشرطي
Summary
هنا، ونحن نصف أداة تحرير الجينوم على أساس الاستقرار الزمني والمشروط من تتجمع بانتظام تكرار palindromic قصيرة متباعدة- (CRISPR-) البروتين المرتبطة 9 (Cas9) تحت جزيء صغير، الدرع-1. ويمكن استخدام هذه الطريقة للخلايا المستزرعة والنماذج الحيوانية.
Abstract
أصبحت تكنولوجيا تكرار palindromic القصيرة المتجمعة بانتظام (CRISPR-) المرتبطة بالبروتين 9 (CRISPR/Cas9) أداة مختبرية سائدة لإدخال تعديلات دقيقة ومستهدفة في الجينوم. ويعزى شعبيته الهائلة وانتشار سريع إلى سهولة استخدامها ودقة بالمقارنة مع سابقاتها. ومع ذلك، فإن التنشيط التأسيسي للنظام له تطبيقات محدودة. في هذه الورقة، ونحن نصف طريقة جديدة تسمح السيطرة الزمنية للنشاط CRISPR/Cas9 على أساس الاستقرار المشروط للبروتين Cas9. دمج متحولة هندسية من البروتين rapamycin ملزمة FKBP12 إلى Cas9 (DD-Cas9) تمكن من التدهور السريع للكاس9 التي بدورها يمكن أن تستقر من خلال وجود ليغاند الاصطناعية FKBP12 (الدرع-1). على عكس الطرق الأخرى غير القابلة للانتهاك ، يمكن تكييف هذا النظام بسهولة لتوليد أنظمة ثنائية ال سيسترونيك للتعبير المشترك عن DD-Cas9 مع جين آخر من الاهتمام ، دون تنظيم مشروط للجين الثاني. تمكن هذه الطريقة من توليد أنظمة يمكن تتبعها بالإضافة إلى التلاعب المستقل الموازي بال alleles المستهدفة من قبل نواة Cas9. ويمكن استخدام منصة هذه الطريقة لتحديد وتوصيف الجينات الأساسية بشكل منهجي واستجواب التفاعلات الوظيفية للجينات في المختبر وفي البيئات الحية.
Introduction
CRISPR-Cas9 الذي يرمز إلى “تتجمع بانتظام باليندروميك قصيرة يكرر البروتين المرتبطة 9” اكتشفت لأول مرة كجزء من الدراسات على مناعة التكيف البكتيري1،2. اليوم، أصبح CRISPR/Cas9 الأداة الأكثر شهرة لتحرير الجينات القابلة للبرمجة وتم تطوير تكرارات مختلفة للنظام للسماح بالتعديلات النسخية واللاجينية3. هذه التكنولوجيا تمكن التلاعب الجيني دقيقة للغاية من أي تسلسل تقريبا من الحمض النووي4.
المكونات الأساسية لأي تحرير الجينات CRISPR هي تسلسل الحمض النووي الريبي دليل للتخصيص ونوكليا Cas95. يرتبط دليل الحمض النووي الريبي بالتسلسل التكميلي المستهدف في الحمض النووي ، ويوجه نواة Cas9 لأداء كسر مزدوج في نقطة محددة في الجينوم3،4. ثم يتم إصلاح موقع الانقسام الناتج عن طريق الربط النهائي غير المتجانس (NHEJ) أو الإصلاح الموجه بالهومولوجيا (HDR) ، مع إدخال تغييرات لاحقة في تسلسل الحمض النووي المستهدف5.
CRISPR /Cas9 القائم على تحرير الجينات سهلة الاستخدام، وغير مكلفة نسبيا بالمقارنة مع تقنيات تحرير الجينات السابقة، وقد ثبت أن تكون فعالة وقوية على حد سواء في تعدد النظم2،4،5. ومع ذلك، فإن النظام يفرض بعض القيود. التعبير التأسيسي لل Cas9 كثيرا ما تبين أن يؤدي إلى زيادة عدد من خارج الأهداف وارتفاعسميةالخلية 4 ،6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستهداف التأسيسي لجينات البقاء على قيد الحياة الأساسية والخلايا من قبل Cas9 يأخذ من قدرته على إجراء أنواع معينة من الدراسات الوظيفية مثل الدراسات الحركية لوفاة الخلية7.
وقد تم تطوير أدوات مختلفة غير قابلة للانعزال أو تسيطر عليها مشروط CRISPR-Cas9 لمعالجة تلك القضايا6، مثل تيت أون وتيت أوف9؛ إعادة التركيب الخاصة بالموقع10; القرب الناجم كيميائيا11; intein الربط التابعة3; و 4-هيدروكسيتاموكسيفين الإستروجين مستقبلات (ER) القائم على أنظمة التعريب النووي12. بشكل عام ، فإن معظم هذه الإجراءات (الربط intein وأنظمة تقسيم القرب الناجمة كيميائيا) لا توفر تحكما قابلا للعكس ، أو تقدم استجابة حركية بطيئة جدا للعلاج الدوائي (نظام Tet-On / Off) ، أو غير قابلة للتلاعب عالي الإنتاجية6.
ولمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير مجموعة أدوات جديدة لا توفر تحرير الجينات السريع والقوية التي يتم التحكم فيها زمنيا فحسب، بل تضمن أيضا إمكانية التتبع، والقابلية للتتبع، والقدرة على الثبات، والقدرة على التلاعب الجيني عالي الإنتاجية. يمكن استخدام هذه التكنولوجيا الجديدة في خطوط الخلايا ، والأعضاء ، والنماذج الحيوانية. ويستند نظامنا على نطاق هندسي، عندما تنصهر في Cas9، فإنه يحفز تدهورها السريع. ومع ذلك، يمكن استقراره بسرعة مع جزيء صغير انتقائي للغاية، غير سام، نفاذية الخلية. وبشكل أكثر تحديدا، قمنا بهندسة FKBP12 الإنسان متحولة “المجال المزعزع للاستقرار” (DD) إلى Cas9، بمناسبة Cas9 للتدهور السريع والتكويني عن طريق نظام ubiquitin-proteasome عندما أعرب في خلايا الثدييات13. يمكن ليغاند DD الاصطناعية، درع-1 استقرار تشكيل DD، وبالتالي منع تدهور البروتينات تنصهر إلى DD (مثل Cas9) بطريقة فعالة جدا، ومع استجابة الحركيةالسريعة 14،15. من الجدير بالذكر، يربط Shield-1 بثلاثة أوامر من الحجم أكثر إحكاما إلى FKBP12 متحولة من نظيرتها البرية من نوع14.
يمكن استخدام زوج DD-Cas9/Shield-1 لدراسة التحديد المنهجي وتوصيف الجينات الأساسية في الخلايا المستزرعة والنماذج الحيوانية كما أظهرنا سابقا من خلال الاستهداف المشروط لجين CypD ، الذي يلعب دورا مهما في عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ؛ EGFR، لاعب رئيسي في التحول أونوجينيك؛ و Tp53، جين مركزي في الاستجابة لتلف الحمض النووي. بالإضافة إلى تحرير الجينات مؤقتا ومشروطا، ميزة أخرى من هذه الطريقة هو أن استقرار DD-Cas9 مستقلة عن النسخ. هذه الميزة تمكن التعبير المشترك، تحت نفس المروج، من علامات يمكن تتبعها، فضلا عن recombinases، مثل recombinase مستقبلات هرمون الاستروجين تعتمد، CREER. في هذا العمل، نظهر كيف يمكن استخدام طريقتنا بنجاح في المختبر، لاستهداف مشروط على سبيل المثال، جين تكرار الحمض النووي، RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
أحدثت تقنية CRISPR/Cas9 ثورة في قدرة استجواب الجينوم2وظيفيا. ومع ذلك ، فإن تعطيل الجينات غالبا ما يؤدي إلى فتك الخلايا ، والعجز الوظيفي ، والعيوب التنموية ، مما يحد من فائدة هذه النهج لدراسة الوظائف الجينية7. بالإضافة إلى ذلك، التعبير التأسيسي لل Cas9 قد يؤدي إلى سمية وتو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الأعضاء السابقين في مختبرنا وعالمنا شريف سينتورك على العمل السابق. نشكر دانيلو سيغوفيا على قراءته الناقدة لهذه المخطوطة. كانت هذه الدراسة ممكنة وبدعم من برنامج السباحة في جميع أنحاء أمريكا والمعهد الوطني للسرطان لاكتشاف أهداف السرطان وتطويره.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
