Un nuevo kit de herramientas para evaluar las funciones genéticas utilizando la estabilización condicional cas9
Summary
Aquí, describimos una herramienta de edición del genoma basada en la estabilización temporal y condicional de la proteína 9 asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) (Cas9) bajo la pequeña molécula, Shield-1. El método se puede utilizar para células cultivadas y modelos animales.
Abstract
La tecnología de proteína 9 asociada a la repetición palindrómica corta (CRISPR/Cas9) agrupada regularmente interespaciada se ha convertido en una herramienta de laboratorio prevalente para introducir modificaciones precisas y específicas en el genoma. Su enorme popularidad y rápida difusión se atribuyen a su fácil uso y precisión en comparación con sus predecesores. Sin embargo, la activación constitutiva del sistema tiene aplicaciones limitadas. En este artículo, describimos un nuevo método que permite el control temporal de la actividad CRISPR/Cas9 basado en la estabilización condicional de la proteína Cas9. La fusión de un mutante diseñado de la proteína de unión a rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) permite la rápida degradación de Cas9 que a su vez puede estabilizarse mediante la presencia de un ligando sintético FKBP12 (Shield-1). A diferencia de otros métodos inducibles, este sistema se puede adaptar fácilmente para generar sistemas bi-cistrónicos para co-expresar DD-Cas9 con otro gen de interés, sin regulación condicional del segundo gen. Este método permite la generación de sistemas trazables, así como la manipulación paralela e independiente de alelos dirigidos por la nucleasa Cas9. La plataforma de este método se puede utilizar para la identificación y caracterización sistemática de genes esenciales y el interrogatorio de las interacciones funcionales de genes en entornos in vitro e in vivo.
Introduction
CRISPR-Cas9 que significa ” proteína asociada arepeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas asociadas” fue descubierta por primera vez como parte de estudios sobre la inmunidad adaptativa bacteriana1,2. Hoy en día, CRISPR/Cas9 se ha convertido en la herramienta más reconocida para la edición de genes programables y se han desarrollado diferentes iteraciones del sistema para permitir modulaciones transcripcionales y epigenéticas3. Esta tecnología permite la manipulación genética de alta precisión de casi cualquier secuencia de ADN4.
Los componentes esenciales de cualquier edición de genes CRISPR son una secuencia de ARN guía personalizable y la nucleasa Cas95. La guía de ARN se une a la secuencia diana-complementaria en el ADN, dirigiendo a la nucleasa Cas9 para realizar una rotura de doble hebra en un punto específico del genoma3,4. El sitio de escisión resultante se repara mediante unión final no homóloga (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR), con la consiguiente introducción de cambios en la secuencia de ADN objetivo5.
La edición de genes basada en CRISPR / Cas9 es fácil de usar y relativamente económica en comparación con las técnicas de edición de genes anteriores y se ha demostrado que es eficiente y robusta en una multiplicidad de sistemas2,4,5. Sin embargo, el sistema presenta algunas limitaciones. A menudo se ha demostrado que la expresión constitutiva de Cas9 da lugar a un mayor número de objetivos no objetivos y una alta toxicidad celular4,6,7,8. Además, la focalización constitutiva de genes esenciales y de supervivencia celular por parte de Cas9 le quita capacidad para realizar ciertos tipos de estudios funcionales como los estudios cinéticos de muerte celular7.
Se han desarrollado diferentes herramientas CRISPR-Cas9 inducibles o controladas condicionalmente para abordar esos problemas6, como Tet-ON y Tet-Off9; recombinación específica del sitio10; proximidad inducida químicamente11; empalme dependiente de inteína3; y sistemas de localización nuclear basados en el receptor de estrógeno (ER) 4-hidroxitamoxifeno12. En general, la mayoría de estos procedimientos (empalme de inteína y sistemas de división de proximidad inducidos químicamente) no ofrecen un control reversible, presentan una respuesta cinética muy lenta al tratamiento farmacológico (sistema Tet-On/Off) o no son susceptibles de manipulación de alto rendimiento6.
Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un nuevo conjunto de herramientas que no solo proporciona una edición de genes controlada temporalmente rápida y robusta, sino que también garantiza la trazabilidad, la capacidad de ajuste y la capacidad de manipulación de genes de alto rendimiento. Esta novedosa tecnología se puede utilizar en líneas celulares, organoides y modelos animales. Nuestro sistema se basa en un dominio de ingeniería, cuando se fusiona con Cas9, induce su rápida degradación. Sin embargo, se puede estabilizar rápidamente con una molécula pequeña altamente selectiva, no tóxica y permeable a las células. Más específicamente, diseñamos el mutante humano FKBP12 “dominio desestabilizador” (DD) a Cas9, marcando Cas9 para una degradación rápida y constitutiva a través del sistema ubiquitina-proteasoma cuando se expresa en células de mamíferos13. El ligando sintético DD, Shield-1 puede estabilizar la conformación DD, evitando así la degradación de proteínas fusionadas a DD (como Cas9) de una manera muy eficiente, y con una respuesta cinética rápida14,15. Cabe destacar que Shield-1 se une con tres órdenes de magnitud más al mutante FKBP12 que a su contraparte de tipo salvaje14.
El par DD-Cas9/Shield-1 se puede utilizar para estudiar la identificación sistemática y caracterización de genes esenciales en células cultivadas y modelos animales, como mostramos anteriormente al dirigirse condicionalmente al gen CypD, que desempeña un papel importante en el metabolismo de las mitocondrias; EGFR, un actor clave en la transformación oncogénica; y Tp53, un gen central en la respuesta al daño del ADN. Además de la edición de genes controlada temporal y condicionalmente, otra ventaja del método es que la estabilización de DD-Cas9 es independiente de su transcripción. Esta característica permite la coexpresión, bajo el mismo promotor, de marcadores trazables así como recombinasas, como la recombinasa dependiente del receptor de estrógenos, CREER. En este trabajo, mostramos cómo nuestro método puede ser utilizado con éxito in vitro, para apuntar condicionalmente, por ejemplo, al gen de replicación del ADN, RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la capacidad de interrogar funcionalmente genomas2. Sin embargo, la inactivación de genes a menudo resulta en letalidad celular, déficits funcionales y defectos de desarrollo, lo que limita la utilidad de tales enfoques para estudiar las funcionesde los genes 7. Además, la expresión constitutiva de Cas9 puede dar lugar a toxicidad y a la generación de efectos fuera del objetivo6. Se han desarrollado di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros anteriores de nuestro laboratorio y al científico Serif Senturk por su trabajo anterior. Agradecemos a Danilo Segovia por leer críticamente este manuscrito. Este estudio fue posible y apoyado por Swim Across America y el programa Cancer Target Discovery and Development Center del Instituto Nacional del Cáncer.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
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