Een nieuwe toolkit voor het evalueren van genfuncties met behulp van voorwaardelijke Cas9-stabilisatie
Summary
Hier beschrijven we een genoombewerkingstool op basis van de temporele en voorwaardelijke stabilisatie van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeat- (CRISPR-) geassocieerd eiwit 9 (Cas9) onder het kleine molecuul, Shield-1. De methode kan worden gebruikt voor gekweekte cellen en diermodellen.
Abstract
De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeat- (CRISPR-) geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) technologie is uitgegroeid tot een veel voorkomend laboratoriuminstrument om nauwkeurige en gerichte modificaties in het genoom te introduceren. De enorme populariteit en snelle verspreiding worden toegeschreven aan het eenvoudige gebruik en de nauwkeurigheid in vergelijking met zijn voorgangers. Toch heeft de constitutieve activering van het systeem beperkte toepassingen. In dit artikel beschrijven we een nieuwe methode die temporele controle van CRISPR/Cas9-activiteit mogelijk maakt op basis van voorwaardelijke stabilisatie van het Cas9-eiwit. Het samensmelten van een gemanipuleerde mutant van het rapamycinebindende eiwit FKBP12 tot Cas9 (DD-Cas9) maakt de snelle afbraak van Cas9 mogelijk die op zijn beurt kan worden gestabiliseerd door de aanwezigheid van een FKBP12 synthetische ligand (Shield-1). In tegenstelling tot andere induceerbare methoden kan dit systeem eenvoudig worden aangepast om bi-cistronic-systemen te genereren om DD-Cas9 samen met een ander interessant gen uit te drukken, zonder voorwaardelijke regulering van het tweede gen. Deze methode maakt het genereren van traceerbare systemen mogelijk, evenals de parallelle, onafhankelijke manipulatie van allelen waarop Cas9 nuclease is gericht. Het platform van deze methode kan worden gebruikt voor de systematische identificatie en karakterisering van essentiële genen en de ondervraging van de functionele interacties van genen in in vitro en in vivo omgevingen.
Introduction
CRISPR-Cas9 , wat staat voor “geclusterd regelmatig interspaced kort palindromisch repeats-geassocieerd eiwit 9” werd voor het eerst ontdekt als onderdeel van studies naar bacteriële adaptieve immuniteit1,2. Tegenwoordig is CRISPR/Cas9 het meest erkende hulpmiddel geworden voor programmeerbare genbewerking en zijn verschillende iteraties van het systeem ontwikkeld om transcriptie- en epigenetische modulaties mogelijk te maken3. Deze technologie maakt de zeer nauwkeurige genetische manipulatie van bijna elke opeenvolging van DNA4 mogelijk.
De essentiële componenten van elke CRISPR-genbewerking zijn een aanpasbare guide RNA-sequentie en de Cas9 nuclease5. De RNA-gids bindt zich aan de doel-complementaire sequentie in het DNA, waardoor de Cas9-nuclease wordt aangedreven om een dubbelstrengsbreuk uit te voeren op een specifiek punt in het genoom3,4. De resulterende decolletésite wordt vervolgens gerepareerd door niet-homologe end-joining (NHEJ) of homologie-gerichte reparatie (HDR), met de daaruit voortvloeiende introductie van veranderingen in de beoogde DNA-sequentie5.
Crispr/Cas9 gebaseerde genbewerking is eenvoudig te gebruiken, en relatief goedkoop in vergelijking met eerdere genbewerkingstechnieken en het is bewezen zowel efficiënt als robuust te zijn in een veelheid van systemen2,4,5. Toch vertoont het systeem enkele beperkingen. Het is vaak aangetoond dat de constitutieve expressie van Cas9 leidt tot een verhoogd aantal off-targets en hoge celtoxiciteit4,6,7,8. Bovendien neemt de constitutieve targeting van essentiële en celoverlevingsgenen door Cas9 afstand van zijn vermogen om bepaalde soorten functionele studies uit te voeren, zoals kinetische studies naar celdood7.
Er zijn verschillende onopleidbare of voorwaardelijk gecontroleerde CRISPR-Cas9-instrumenten ontwikkeld om deze problemen aan te pakken6, zoals Tet-ON en Tet-Off9; locatiespecifieke recombinatie10; chemisch geïnduceerde nabijheid11; inteïneafhankelijke splicing3; en 4-Hydroxytamoxifen Oestrogeen Receptor (ER) gebaseerde nucleaire lokalisatie systemen12. Over het algemeen bieden de meeste van deze procedures (inteine splicing en chemisch geïnduceerde proximity split-systemen) geen omkeerbare controle, vertonen ze een zeer trage kinetische respons op medicamenteuze behandeling (Tet-On/Off-systeem) of zijn ze niet vatbaar voor manipulatie met hoge doorvoer6.
Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een nieuwe toolkit ontwikkeld die niet alleen snelle en robuuste temporele-gecontroleerde genbewerking biedt, maar ook zorgt voor traceerbaarheid, afstemming en ontvankelijkheid voor genmanipulatie met hoge doorvoer. Deze nieuwe technologie kan worden gebruikt in cellijnen, organoïden en diermodellen. Ons systeem is gebaseerd op een ontworpen domein, wanneer het is gesmolten met Cas9, veroorzaakt het zijn snelle afbraak. Het kan echter snel worden gestabiliseerd met een zeer selectief, niet-toxisch, celdoorlatend klein molecuul. Meer specifiek hebben we de menselijke FKBP12 mutant “destabiliserend domein” (DD) naar Cas9 ontworpen, waarbij Cas9 werd gemarkeerd voor snelle en constitutieve afbraak via het ubiquitin-proteasoomsysteem wanneer uitgedrukt in zoogdiercellen13. De DD synthetische ligand, Shield-1 kan DD-conformatie stabiliseren, waardoor de afbraak van eiwitten die zijn gesmolten tot DD (zoals Cas9) op een zeer efficiënte manier wordt voorkomen, en met een snelle kinetische respons14,15. Van belang, Shield-1 bindt met drie ordes van grootte strakker aan de mutant FKBP12 dan aan zijn wild-type tegenhanger14.
Het DD-Cas9/Shield-1-paar kan worden gebruikt om de systematische identificatie en karakterisering van essentiële genen in gekweekte cellen en diermodellen te bestuderen, zoals we eerder hebben laten zien door ons voorwaardelijk te richten op het CypD-gen, dat een belangrijke rol speelt in het metabolisme van mitochondriën; EGFR, een belangrijke speler in oncogene transformatie; en Tp53, een centraal gen in dna-schaderespons. Naast tijdelijk en voorwaardelijk gecontroleerde genbewerking is een ander voordeel van de methode dat de stabilisatie van DD-Cas9 onafhankelijk is van de transcriptie ervan. Deze functie maakt co-expressie, onder dezelfde promotor, van traceerbare markers en recombinases mogelijk, zoals de oestrogeenreceptorafhankelijke recombinase, CREER. In dit werk laten we zien hoe onze methode succesvol in vitro kan worden gebruikt, om bijvoorbeeld dna-replicatiegen RPA3 voorwaardelijk te targeten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De CRISPR/Cas9-technologie heeft een revolutie teweeggebracht in het vermogen om genomen functioneel te ondervragen2. De inactivatie van genen resulteert echter vaak in celdoodheid, functionele tekorten en ontwikkelingsstoornissen, waardoor het nut van dergelijke benaderingen voor het bestuderen van genfuncties wordt beperkt7. Bovendien kan constitutieve expressie van Cas9 leiden tot toxiciteit en het genereren van off-target effecten6. Er zijn versc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken eerdere leden van ons laboratorium en wetenschapper Serif Senturk voor eerder werk. Wij danken Danilo Segovia voor het kritisch lezen van dit manuscript. Deze studie was mogelijk en werd ondersteund door Swim Across America en het National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-programma.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
