Новый инструментарий для оценки функций генов с использованием условной стабилизации Cas9
Summary
Здесь мы описываем инструмент редактирования генома, основанный на временной и условной стабилизации кластеризованного регулярно интерширизованного короткого палиндромного повторного (CRISPR-) ассоциированного белка 9 (Cas9) под небольшой молекулой Shield-1. Метод может быть использован для культивированных клеток и животных моделей.
Abstract
Кластерная регулярно интерширидная технология короткого палиндромного повторного (CRISPR-) белка 9 (CRISPR / Cas9) стала распространенным лабораторным инструментом для введения точных и целенаправленных модификаций в геном. Его огромная популярность и быстрое распространение объясняются его простотой использования и точностью по сравнению с предшественниками. Тем не менее, конститутивная активация системы имеет ограниченное применение. В данной работе описан новый метод, позволяющий временно контролировать активность CRISPR/Cas9 на основе условной стабилизации белка Cas9. Слияние инженерного мутанта рапамицин-связывающего белка FKBP12 с Cas9 (DD-Cas9) позволяет быстро разбавлять Cas9, что, в свою очередь, может быть стабилизировано присутствием синтетического лиганда FKBP12 (Shield-1). В отличие от других индуцируемых методов, эта система может быть легко адаптирована для генерации бицистронных систем для совместной экспрессии DD-Cas9 с другим интересуемым геном без условной регуляции второго гена. Этот метод позволяет создавать прослеживаемые системы, а также параллельное, независимое манипулирование аллелями, на которые нацелена нуклеаза Cas9. Платформа этого метода может быть использована для систематической идентификации и характеристики эссенциального гена и опроса функциональных взаимодействий генов in vitro и in vivo.
Introduction
CRISPR-Cas9, который расшифровывается как«кластеризованный регулярно чередуемый короткий палиндромно-связанный с повторами белок 9»,был впервые обнаружен в рамках исследований бактериального адаптивного иммунитета1,2. Сегодня CRISPR/Cas9 стал наиболее признанным инструментом для программируемого редактирования генов, и были разработаны различные итерации системы, позволяющие транскрипционные и эпигенетические модуляции3. Эта технология позволяет высокоточную генетическую манипуляцию практически с любой последовательностью ДНК4.
Основными компонентами любого редактирования гена CRISPR являются настраиваемая направляющая последовательность РНК и нуклеаза Cas95. Направляющая РНК связывается с мишенью-комплементарной последовательностью в ДНК, направляя нуклеазу Cas9 на выполнение двухцепочечного разрыва в определенной точкегенома3,4. Полученный участок расщепления затем восстанавливается путем негомологичного конечного соединения (NHEJ) или гомологического репарации (HDR) с последующим введением изменений в целевую последовательность ДНК5.
Редактирование генов на основе CRISPR / Cas9 просто в использовании и относительно недорого по сравнению с предыдущими методами редактирования генов, и было доказано, что оно эффективно и надежно во множестве систем2,4,5. Тем не менее, система имеет некоторые ограничения. Часто было показано, что конститутивная экспрессия Cas9 приводит к увеличению числа нецелей и высокой клеточной токсичности4,6,7,8. Кроме того, конститутивное нацеливание на эссенциальности и гены выживания клеток Cas9 низводит его способность выполнять определенные типы функциональных исследований, таких как кинетические исследования гибели клеток7.
Для решения этих проблем6были разработаны различные индуцируемые или условно управляемые инструменты CRISPR-Cas9, такие как Tet-ON и Tet-Off9; сайт-специфическая рекомбинация10; химически индуцированная близость11; интейн-зависимый сращивание3; и системы ядерной локализации на основе 4-гидрокситамоксифен-эстроген-рецептора (ER)12. В целом, большинство из этих процедур (сращивание интеина и химически индуцированные системы бесконтактного расщепления) не обеспечивают обратимого контроля, представляют очень медленный кинетический ответ на медикаментозное лечение (система Tet-On/Off) или не поддаются высокопроизводительный манипуляции6.
Для устранения этих ограничений мы разработали новый инструментарий, который не только обеспечивает быстрое и надежное редактирование генов, контролируемое временем, но также обеспечивает прослеживаемость, настраиваемость и пригодность для высокопроизводительных манипуляций с генами. Эта новая технология может быть использована в клеточных линиях, органоидах и животных моделях. Наша система основана на инженерном домене, при сращений с Cas9 она вызывает его быструю деградацию. Тем не менее, он может быть быстро стабилизирован с помощью высокоселективной, нетоксичной, проницаемой для клеток малой молекулы. Более конкретно, мы спроектировали мутантный «дестабилизирующее домен» человека FKBP12 (DD) в Cas9, обозначив Cas9 для быстрой и конститутивной деградации через систему убиквитин-протеасома при экспрессии в клетках млекопитающих13. Синтетический лиганд DD Shield-1 может стабилизировать конформацию DD, тем самым предотвращая деградацию белков, слитых с DD (таких как Cas9) очень эффективным образом и с быстрым кинетическим ответом14,15. Следует отметить, что Shield-1 связывается на три порядка плотнее с мутантом FKBP12, чем с его аналогом дикого типа14.
Пара DD-Cas9/Shield-1 может быть использована для изучения систематической идентификации и характеристики основных генов в культивируемых клетках и животных моделях, как мы ранее показали, путем условного нацеливания на ген CypD, который играет важную роль в метаболизме митохондрий; EGFR, ключевой игрок в онкогенной трансформации; и Tp53, центральный ген в реакции на повреждение ДНК. В дополнение к временному и условно контролируемому редактированию генов, еще одним преимуществом метода является то, что стабилизация DD-Cas9 не зависит от его транскрипции. Эта функция обеспечивает коэкспрессию под одним и тем же промотором прослеживаемых маркеров, а также рекомбиназ, таких как эстроген-рецептор-зависимая рекомбиназа, CREER. В этой работе мы показываем, как наш метод может быть успешно использован in vitro, чтобы условно нацеливаться, например, на ген репликации ДНК, RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Технология CRISPR/Cas9 произвела революцию в возможности функционального опроса геномов2. Однако инактивация генов часто приводит к летальности клеток, функциональному дефициту и дефектам развития, ограничивая полезность таких подходов для изучения функций генов7.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим предыдущих сотрудников нашей лаборатории и ученого Серифа Сентурка за предыдущую работу. Мы благодарим Данило Сеговию за критическое прочтение этой рукописи. Это исследование было возможным и поддержано программой Swim Across America и Национального института рака Cancer Target Discovery and Development Center.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
