ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9
Summary
כאן, אנו מתארים כלי לעריכת גנום המבוסס על ייצוב זמני ומותנה של מקובצים באופן קבוע בין-חללים קצרים פלינדרומיים חוזרים- (CRISPR-) חלבון הקשורים 9 (Cas9) תחת המולקולה הקטנה, Shield-1. השיטה יכולה לשמש לתאים בתרבית ומודלים של בעלי חיים.
Abstract
טכנולוגיית החלבון 9 (CRISPR/Cas9) המשויכת באופן קבוע לתחביבים קצרים הפכה לכלי מעבדה נפוץ כדי להציג שינויים מדויקים וממוקדים בגנום. הפופולריות העצומה שלה והתפשטות מהירה מיוחסים לשימושו הקל ודיוק בהשוואה לקודמיו. עם זאת, ההפעלה המכוננת של המערכת מוגבלת. במאמר זה, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת שליטה זמנית של פעילות CRISPR/Cas9 המבוססת על ייצוב מותנה של חלבון Cas9. היתוך מוטציה מהונדסת של חלבון מחייב rapamycin FKBP12 ל- Cas9 (DD-Cas9) מאפשר השפלה מהירה של Cas9 כי בתורו ניתן לייצב על ידי נוכחות של ליגנד סינתטי FKBP12 (מגן-1). שלא כמו שיטות לא מובלות אחרות, ניתן להתאים מערכת זו בקלות כדי ליצור מערכות דו-ציסטרוניות לבטא DD-Cas9 עם גן אחר של עניין, ללא ויסות מותנה של הגן השני. שיטה זו מאפשרת ייצור מערכות הניתנות למעקב, כמו גם מניפולציה מקבילה ועצמאית של אללים הממוקדים על ידי נוקלאז Cas9. הפלטפורמה של שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי ואפיון שיטתיים של גנים חיוניים וחקירת האינטראקציות התפקודיות של הגנים בהגדרות במבחנה וב- vivo.
Introduction
CRISPR-Cas9 אשר מייצג “מקובצים באופן קבוע interspaced קצר פלינדרומי חוזר חלבון הקשורים 9” התגלה לראשונה כחלק ממחקרים עלחסינותאדפטיבית חיידקית 1,2. כיום, CRISPR/ Cas9 הפך לכלי המוכר ביותר לעריכת גנים הניתנת לתכנות ואיטרציות שונות של המערכת פותחו כדי לאפשר אפנון תמלול ואפיגנטי3. טכנולוגיה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת ביותר של כמעט כל רצף של DNA4.
הרכיבים החיוניים של כל עריכת גנים CRISPR הם רצף RNA מדריך להתאמה אישית ואת נוקלאז Cas95. מדריך הרנ”א נקשר לרצף המשלים את המטרה בדנ”א, ומכוון את גרעין Cas9 לבצע שבירה כפולה בנקודה מסוימת בגנום3,4. אתר המחשוף המתקבל מתוקן לאחר מכן על ידי צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מונחה ההומולוגיה (HDR), עם כניסתם של שינויים ברצף ה- DNA הממוקד5.
עריכת גנים מבוססת CRISPR/Cas9 היא קלה לשימוש, וזולה יחסית לטכניקות קודמות לעריכתגניםוהיא הוכחה כיעילה וחזקה בריבוי מערכות 2,4,5. עם זאת, המערכת מציגה כמה מגבלות. הביטוי המכונן של Cas9 הוכח לעתים קרובות כתוצאה של מספר מוגבר של מטרות מחוץ למטרות ורעילות תאים גבוהה4,6,7,8. בנוסף, מיקוד המכונן של גנים חיוניים והישרדות תאים על ידי Cas9 לוקח את יכולתו לבצע סוגים מסוימים של מחקרים פונקציונליים כגון מחקרים קינטיים של מוות תאים7.
כלי CRISPR-Cas9 שונים, שאינם ניתנים לערעור או מבוקרים מותנית, פותחו כדי לטפל בבעיות6, כגון Tet-ON ו-Tet-Off9; רקומבינציה ספציפית לאתר10; קרבה כימית11; intein תלוי splicing3; ו 4-Hydroxytamoxifen אסטרוגן קולטן (ER) מבוסס מערכות לוקליזציה גרעינית12. באופן כללי, רוב ההליכים האלה (חיבור intein ומערכות פיצול קרבה המושרה כימית) אינם מציעים שליטה הפיכה, מציגים תגובה קינטית איטית מאוד לטיפול תרופתי (מערכת Tet-On/Off), או אינם מקובלים על מניפולציה בתפוקה גבוהה6.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה פיתחנו ערכת כלים חדשנית שלא רק מספקת עריכת גנים מהירה וחזקה הנשלטת על ידי הזמן, אלא גם מבטיחה עקיבות, יכולת טונה וזמינות למניפולציה גנטית בתפוקה גבוהה. טכנולוגיה חדשנית זו יכולה לשמש קווי תאים, organoids, ומודלים בעלי חיים. המערכת שלנו מבוססת על תחום מהונדס, כאשר מותך Cas9, זה גרים השפלה מהירה שלה. עם זאת, ניתן לייצב אותו במהירות עם מולקולה קטנה סלקטיבית מאוד, לא רעילה, חדירת לתא. ליתר דיוק, הנדסנו את המוטציה האנושית FKBP12 “תחום מערער” (DD) ל- Cas9, מסמנת את Cas9 להשפלה מהירה ומהורכבת באמצעות מערכת אוביקוויטין-פרוטאזום כאשר היא באה לידי ביטוי בתאי יונקים13. ליגנד סינתטי DD, Shield-1 יכול לייצב את התאמת DD, ובכך למנוע את השפלה של חלבונים הותכו DD (כגון Cas9) בצורה יעילה מאוד, ועם תגובה קינטית מהירה14,15. שימו לב, מגן-1 נקשר עם שלושה סדרי גודל הדוקים יותר ל- FKBP12 המוטנטי מאשר למקבילו הפראי14.
ניתן להשתמש בזוג DD-Cas9/Shield-1 כדי לחקור את הזיהוי והאפיון השיטתיים של גנים חיוניים בתאים מתורבתים ומודלים של בעלי חיים כפי שהראנו בעבר על ידי מיקוד מותנה בגן CypD, הממלא תפקיד חשוב בחילוף החומרים של המיטוכונדריה; EGFR, שחקן מפתח בטרנספורמציה אונקוגנית; ו Tp53, גן מרכזי בתגובת נזק DNA. בנוסף לעריכת גנים מבוקרת זמנית ומותנית, יתרון נוסף של השיטה הוא שהתייצבות DD-Cas9 אינה תלויה בתעתיק שלה. תכונה זו מאפשרת ביטוי משותף, תחת אותו מקדם, של סמנים למעקב, כמו גם רקומבינסות, כגון רקומבינאז תלוי קולטן אסטרוגן, CREER. בעבודה זו, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה שלנו בהצלחה במבחנה, כדי למקד באופן מותנה למשל, גן שכפול DNA, RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה ביכולת לחקור באופן פונקציונלי גנומים2. עם זאת, חוסר הפעילות של גנים לעתים קרובות גורם קטלניות התא, ליקויים תפקודיים, פגמים התפתחותיים, הגבלת התועלת של גישות כאלה לחקרפונקציות גנים 7. בנוסף, ביטוי ממהווה את Cas9 עלול לגרום לרעילות וליציר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברים קודמים במעבדה שלנו ולמדען שלנו, סריף סנטרק, על עבודה קודמת. אנו מודים לדנילו סגוביה שקרא את כתב היד הזה בביקורתיות. מחקר זה היה אפשרי ונתמך על ידי לשחות ברחבי אמריקה ואת המכון הלאומי לסרטן היעד גילוי ופיתוח תוכנית.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
