التصور والتقدير الكمي للبيانات الخلوية عاليه الابعاد باستخدام سيتوسياست وأساليب التجميع المنبع FlowSOM و Cytosplore

تمت الموافقة علي جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنه التجارب الحيوانية من LUMC وأعدم وفقا للمبادئ التوجيهية التجارب الحيوانية لل LUMC امتثالا للمبادئ التوجيهية للجان الهولندية والاوروبيه. ملاحظه: بالنسبة لمجموعه تجريبية ، C57BL/6 الفئران جلد تطعيم علي الجناح الأيمن مع ورم القولون MURINE MC38 في تركيز 0.3 × 106 خلايا/200 μl من الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني). بعد 10 أيام ، عندما كانت الأورام محسوسة ، عولجت الفئران مع الأجسام المضادة لحجب PD-L1 (استنساخ MIH ، 200 ميكروغرام/الماوس ، حقن داخل الصفاق) أو كانت وهميه المعالجة. وقد تم تقسيم الأورام بعد 3 أيام بعد حقن PD-L1 ، ومعالجتها الجسم السابق ، وتحليلها من قبل سيتوف الكتلة الخلوية باستخدام علامات 3813. 1. المعدات والبرمجيات لتحليل البيانات ملاحظه: استخدام الكمبيوتر (ويندوز 7 أو أحدث) والمعالج I5 في 2.4 GHz أو ما يعادلها ، والذاكرة المثبتة RAM 6 غيغابايت ، و 10 غيغابايت من مساحة القرص الصلب الحرة. الحزمة R سيتوسريع يستخدم الوظائف الموجودة: أساسا flowcore، فياتماب، و ggplot. يتم تضمين أسطر الأوامر التي سيتم تنفيذها في R في البروتوكول. يمكن العثور علي المورد للحصول علي تعليمات R في https://education.rstudio.com/. لتثبيت حزمه سيتوfast ، بدء R (الإصدار “3.6”) وتثبيت بيوككتور الإصدار 3.9 عن طريق إدخال التعليمه البرمجية التالية:إذا كان (! ريكورينامسبيس (“الاداره الحيوية” ، بهدوء = TRUE))تثبيت. حزم (“الحيوية مدير”)الاداره الحيوية:: تثبيت (“السرعة الخلوية”) تاكد من تحميل الحزمة في البيئة المطلوبة عن طريق تشغيل ما يلي:مكتبه (سيتوصوم) 2-إنشاء التكتلات ملاحظه: لعرض طريقتي التجميع Cytosplore و flowsom مع سيتوصوم، وخلايا NK (CD161 +) في الورم الصغرى البيئة 3 أيام بعد تحليل PD-L1 العلاج. التجميع الذي يقوم بهCytosplore بعد تحميل وتثبيت Cytosplore، استضافت في < www. > ، تحميل ملفات. fcs (الملفاتالتكميلية 1.1 – 1.8 [cytosplore ملفات الإدخال]) بالنقر فوق ملف | فتح FCS ملف (s) في Cytosplore. أضافه علامة نموذج فريد كقناة بالنقر فوق أضافه علامة نموذج فريد كقناة عند المطالبة وتحديد عامل مساعد لتحويل arcsinh القطعي (الافتراضي هو 5). حدد تشغيل H-SNE، قم بتشغيل مستوي hsne من 3 ، وانتظر حتى يتم إنشاء الخريطة.ملاحظه: قد تتطلب هذه الخطوة بعض الوقت ، اعتمادا علي عدد الخلايا التي تم تحليلها ومستوي HSNE الذي تم اختياره. علي مستوي HSNE الأول ، تحقق من الخلايا التي تكون موجبه ل CD161. حدد الخلاياCD161 + وانقر بزر الماوس الأيمن فوق تكبير/تصغير في التحديد. في المستوي الثاني ، كرر الاجراء للوصول إلى المستوي الثالث مع فقطCD161 + الاحداث. مره واحده يتم إنشاء الخريطة tSNE آخر ، حفظ الكتل المعرفة من قبل Cytosplore عن طريق النقر بزر الأيمن علي الخريطة tsne واختيار حفظ الكتل. اختر دليل ملفات الإخراج كما هو مدفوع من قبل Cytosplore ولاحظ هذا الموقع ، لأنه سيتم استخدام هذا الدليل ثم تحميل ملفات. Fcs إلى R.ملاحظه: يمكن تغيير عدد المجموعات الفرعية يدويا عن طريق تغيير قيمه سيغما. يتم تعيين قيمه سيغما بشكل افتراضي في 30; ومع ذلك ، يعتمد العدد الفعلي لمجموعات فرعيه علي الإدخال. هنا ، اكتشفت Cytosplore 10 مجموعات فرعيه مختلفه ، مع كل ملف يمثل مجموعه جزئيه واحده. استخدم اسما بسيطا (الأحرف فقط) عند أعاده تسميه ملفات الإخراج ، والتي ستجعل التعريف والمزيد من المعالجة أسهل. حفظ ملفات الإخراج عن طريق تحديد حفظ.ملاحظه: بعد الحفظ ، يتم إنشاء مجلد بواسطة cytosplore مع ملفات. fcs ، مع كل ملف المطابق للمجموعات المحددة في cytosplore. الخطوة التالية سيتم تحميل الملفات إلى R بمساعده سيتوصوم. هنا ، يتم توفير ملفات الإخراج التي تم إنشاؤها في ملفات تكميليه 2.1 – 2.10 (ملفات إخراج cytosplore). تحميل ملفات الإخراج التي تم إنشاؤها بواسطة Cytosplore إلى R مع الدالة المعينة: readCytosploreFCS.ال< dirFCS-"C:\\users\username\\doctortolort"cfData <-readCytosploreFCS (dir = dirFCS ، colNames = "الوصف") تنظيف البيانات عن طريق أزاله بعض المعلمات مثل “الوقت” و “الخلفية”. تحقق من موضع العمود المتعلق بمعلماته غير الضرورية وقم بإزالته من المصفوفة.الأسماء (cfData@expr)cfData@expr <-cfData@expr [،-ج (3 ، 4 ، 6 ، 8:10 ، 46:49 ، 51:54)]ملاحظه: يمكن مشاهده الاعمده غير الضرورية عن طريق قراءه أسماء الاعمده من المصفوفة التي تم إنشاؤها. عن طريق تشغيل colnames (cfData@expr) مره أخرى ، تاكد من ان يتم الحصول علي المعلمات المطلوبة فقط. أعد ترتيب العلامات بحيث يتم عرض علامات النسب أولا ، متبوعه بعلامات وظيفية.cfData@expr <-cfData@expr [، ج (1 ، 2 ، 3 ، 35 ، 36 ، 31 ، 9 ، 10 ، 18 ، 8 ، 37 ، 20 ،29 ، 40 ، 5 ، 30 ، 33 ، 11 ، 34 ، 14 ، 19 ،32 ، 28 ، 6 ، 7 ، 4 ، 12 ، 13 ، 17 ، 16 ، 15 ،21 و 22 و 24 و 25 و 26 و 27 و 38 و 39) [ملاحظه: الخطوة 2-1-8 اختياريه. ربط ملف بيانات الفوقية للبيانات التي تم إنشاؤها من cytosplore عن طريق تحميل ملف تعريف جدول البيانات التي تحتوي علي المعلومات السريرية (التكميلية 3).مكتبه (readxl)ال< الفوقية-read_excel ("C:\\users\username\\doct\\\ sample_id. xlsx")cfData@samples <-البيانات. الإطار (meta)ملاحظه: يتم الآن الانتهاء من التجميع الذي يتم تنفيذه بواسطة Cytosplore . خيار التجميع بديل ل Cytosplore هو flowsom وهو موضح في القسم 2.2. بمجرد تنفيذ أحدي خطوتي التجميع ، تابع خطوه المرئيات (القسم 3). التجميع الذي يقوم بهFlowSOM أولا تثبيت Flowsom في R عن طريق تشغيل الأمر التالي:إذا كان (! ريكورينامسبيس (“الاداره الحيوية” ، بهدوء = TRUE))تثبيت. حزم (“الحيوية مدير”)بيومانجر:: تثبيت (“FlowSOM”)مكتبه (فلوسوم) قم بتثبيت حزمه flowCore باستخدام أسلوب مشابه وتحميله في البيئة عن طريق تشغيل ما يلي:إذا كان (! ريكورينامسبيس (“الاداره الحيوية” ، بهدوء = TRUE))تثبيت. حزم (“الحيوية مدير”)بيومانجر:: تثبيت (“flowCore”)مكتبه (فلوسوم) تحميل البيانات الاوليه المتوفرة في الملفات التكميلية 4.1 – 4.8 (FCS flowsom الإدخال) ، التي كانت بوابات مسبقا علي CD161 + الاحداث ، في R مع الدالة قراءه. فلوتيمجموعه.fcs_raw <-القراءة. flowSet (المسار = "C:\\users\username\\doct\\tolettatit" ، نقش = "fcs" ، التحويل = FALSE ، truncate_max_range = FALSE ، البذور = 123) حدد العلامات البيولوجية ذات الصلة (أزاله “الخلفية” أو “الوقت”) عن طريق تحديد الاعمده المناسبة وتحويل البيانات بطريقه arcsinh5 كما هو موضح في التعليمات البرمجية أدناه (هنا ، أزاله الاعمده 1 ، 2 ، 4 ، 5 ، 6 ، 17 ، 21 ، 24 ، 25 ، 34 ، 35 ، 51 38 37 تطبيق عامل مساعد من 5 كما سبق تطبيقها مع cytosplore، عن طريق اختيار مساعد = 5 في الدالة أدناه.fcs_raw <-fsApply (fcs_raw ، وظيفة (س ، العامل المساعد = 5) {الأسماء (x) < fcs_raw [[1]] @parameters @data $ descexpr <-exprs (x)expr <-asinh (expr [،-c (1 ، 2 ، 4 ، 5 ، 6 ، 17 ، 21 ، 24 ، 25 ، 34 ، 35 ، 37 ، 38 ، 51)]/cofactor)exprs (x) <-exprالعودة (x)}) كتله البيانات باستخدام الدالة Flowsom . لمقارنه Flowsom و cytosplore، اختر لتجميع البيانات في عشر مجموعات فرعيه كالاخراج الذي تم إنتاجه مسبقا بواسطة cytosplore.fsom <-فلوسوم (fcs_raw ، التحويلية = FALSE ، مقياس = FALSE ،تحجيم. توسيط = FALSE ، تحجيم. مقياس = FALSE ، صامت = FALSE ، colsToUse = c (1:37) ،nClus = 10 ، maxMeta = 10 ، اهميه = NULL ، البذور = 123)ملاحظه: يمكن تغيير هذا يدويا بواسطة المستخدم. تعيين كل خليه إلى المجموعة الفرعية المحددة ومعرف العينة.subset_id <-كعامل (fsom $ فلوسوم $ خريطة $ رسم الخرائط [, 1])المستويات (subset_id) <رئيس (subset_id) تحميل ملف بيانات التعريف في R (متوفر في الملف التكميلي 5) الذي يحتوي علي تعيين المجموعة وربطه بملفات. fcs.sampleid <-الread_excel ("C:\\users\username\\doct\\\ sample_id. xlsx")سامبلييد <-نا. حذف (سامبلييد)sampleid $ sampleID <-كعامل (sampleid $ sampleID)مجموعه سامبلييد $ <-كعامل (مجموعه سامبلييد $)sampleid $ CSPLR_ST <-كعامل (sampleid $ CSPLR_ST)سامبلييد <-كاطار البيانات (سامبلييد)الأسماء (sampleid) [3] <-"sampleID"sampleID <-lapply (fsom $ FlowSOM $ البيانات الوصفية ، وظيفة (س) {rep (x [1] ، كل = طول (x [1]: x [2])))})attr (sampleID ، ‘ أسماء ‘) <-NULLsampleID < كعامل (إلغاء القائمة (سامبلييد))sampleid <-البيانات. الإطار (سامبلييد)المستويات (sampleID) <-لصق ("ID" ، 1: dim (sampleid) [1] ، sep = "_")df <-البيانات. الإطار (subset_id ، sampleID ، fsom $ فلوسوم $ البيانات [، c (1:37)])أعاده تسميه <-البيانات. الإطار (colpar = fcs_raw [[1]] @parameters @data $ desc)الأسماء (df) <-c ("كلوستريد" ، "sampleID" ، أعاده تسميه $ colnames [c (1:37)])df $ كلوسترينيد <-كعامل (df $ كلوسترريد)df $ sampleID <-كعامل (df $ sampleID) إنشاء cfList استنادا إلى dataframe الحصول عليها من Flowsom بواسطة تشغيل البرنامج النصي التالي:cfData <-cfList (عينات = sampleid ،expr = df) أعاده ترتيب علامات لتظهر علي نحو مماثل للإخراج من تحليل Cytosplore .cfData@expr <-cfData@expr [، جيم (1 ، 2 ، 34 ، 36 ، 37 ، 10 ، 23 ، 24 ، 31 ، 22 ،38 ، 15 ، 8 ، 3 ، 27 ، 9 ، 11 ، 28 ، 35 ، 26 ،14 ، 33 ، 17 ، 20 ، 21 ، 18 ، 25 ، 29 ، 13 ،30 ، 12 ، 16 ، 32 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 19 ، 39)]ملاحظه: تم الآن الانتهاء من التجميع بواسطة flowsom . بعد ذلك ، قم بتنفيذ التصور لإخراج التجميع. 3. التصور: تحليل التجميع بعد المعالجة ملاحظه: هذه الخطوة هي الطريقة الشائعة لكل من أساليب التجميع. ولذلك ، يمكن تنفيذه بعد تجميع اما مع Flowsom أو Cytosplore. قبل إنشاء خرائط الحرارة ، إنشاء جدول العد لكل نموذج باستخدام الخلايا الدالة كما هو موضح في التعليمات البرمجية أدناه. وبما ان بعض التكتلات تحتوي علي خلايا اقل من غيرها ، فانها تقوم بقياس البيانات لكل مجموعه عن طريق تحديد “المقياس = TRUE” داخل الخلية الوظيفية ، بحيث يمكن رؤية التشتت بين العينات بسهوله.cfData <-سيلتهم (cfData ، التردد = TRUE ، مقياس = TRUE)ملاحظه: يمكن الآن تصور البيانات. تصور مع خريطة الحرارة.ملاحظه: واحده من الوظائف الرئيسية لهذه الحزمة هي الخرائط الخلوية ، والتي تستخدم لتصور النمط الظاهري للمجموعات التي تم إنشاؤها ، فضلا عن تغايرها فيما يتعلق بالعينات.الخرائط الخلوية (cfData ، المجموعة = “المجموعة” ، وسيله الإيضاح = TRUE) التصور مع boxplotsاتملاحظه: يمكن تمثيل البيانات بطريقه كميه عن طريق استدعاء داله cytoBoxplotsات. يمثل إخراج هذه الدالة نسبه كل نموذج لكل مجموعه. إنشاء عدد الخلايا كما تم في الخطوة 3.1 ولكن لا تحجيم البيانات للحصول علي تكرار كل كتله.cfData <-سيلتهم (cfData ، التردد = TRUE ، مقياس = FALSE)cytoBoxplotsات (cfData ، المجموعة = “المجموعة”) التصور مع متوسط كثافة اشاره الرسم البيانيملاحظه: يمكن أيضا تصور البيانات من خلال تمثيل الرسم البياني اشاره كثافة متوسط. تصور شده التعبير من ثلاث علامات: CD45 ، CD11c ، و CD54. تحقق من أسماء العلامات المطلوبة عن طريق استدعاء السطر التالي. لاحظ أسماء العلامات وتضمينها في الدالة مسارسم.الأسماء (cfData@expr)ملاحظه: هنا ، التركيز علي CD45 ، CD11c ، و CD54. تحقق من الإملاء الدقيق للعلامات واضبط إذا لزم الأمر:المؤامرة (cfData ، علامات = c (“89Y_CD45” ، “167Er_CD11c” ، “164Dy_CD54”) ، byGroup = ‘ المجموعة ‘)