Sitofast ve Upstream Kümeleme Yöntemleri FlowSOM ve Cytosplore kullanılarak Yüksek Boyutlu Sitometri Verilerinin Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi

Tüm hayvan deneyleri LUMC Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından onaylandı ve Hollanda ve Avrupa komitelerinin yönergelerine uygun olarak LUMC’nin hayvan deneyleri yönergelerine uygun olarak yürütüldü. NOT: Deneysel kurulum için C57BL/6 fareler sağ kanadında 0.3 x 106 hücre/200 μL fosfat tamponlu salin (PBS) konsantrasyonunda minür kolon tümörü MC38 ile subkutan olarak aşılandı. Tümörlerin hissedilir olduğu 10 gün sonra fareler PD-L1 bloke edici antikorlarla (klon MIH-5, 200 μg/fare, intra-periton enjeksiyonu) veya sahte tedavi ile tedavi edildi. Tümörler PD-L1 enjeksiyonundan 3 gün sonra rezeke edildi, ex vivo işlendi ve CyTOF kitle sitometrisi tarafından 38 belirteç kullanılarak analiz edildi13. 1. Veri Analizi için Ekipman ve Yazılım NOT: 2,4 GHz veya eşdeğeri, yüklü bellek RAM 6 GB ve 10 GB ücretsiz sabit disk alanı ile bilgisayar (Windows 7 veya daha yeni) ve işlemci I5 kullanın. R paketi Cytofast mevcut işlevleri kullanır: esas olarak flowCore, pheatmap, ve ggplot. R’de yürütülecek komut satırları protokole dahil edilir. R talimatları için kaynak https://education.rstudio.com/bulunabilir. Cytofast paketini yüklemek için, R’yi (sürüm “3.6”) başlatın ve aşağıdaki kodu girerek Bioconductor sürüm 3.9’u yükleyin:if (!requireNamespace(“BiocManager”, sessizce = TRUE))install.packages(“BiocManager”)BiocManager::install(“cytofast”) Aşağıdakileri çalıştırarak paketin istenilen ortama yüklendiğinden emin olun:kütüphane(sitofast) 2. Kümeoluşturma NOT: Cytosplore ve FlowSOM ile Sitofastile iki kümelenme yöntemini sergilemek için, PD-L1 tedavisinden 3 gün sonra tümör mikro ortamında NK hücreleri (CD161+) analiz edilir. Tarafından gerçekleştirilen kümelemeCytosplore Cytosplore’uindirdikten ve yükledikten sonra <www adresinde barındırılan. Sitosplore.org>, .fcs dosyalarını yükleyin (Ek Dosyalar 1.1-1.8 [Cytosplore giriş dosyaları]) Dosyayı tıklayarak | Cytosplore’daFCS Dosya(lar)’ı açın. İstendiğinde kanal olarak benzersiz örnek etiketi ekle’yi tıklatarak kanal olarak benzersiz bir örnek etiketi ekleyin ve hiperbolik arksinh dönüşümü için bir kofaktör seçin (varsayılan değer 5’tir). H-SNE Çalıştır’ıseçin, HSNE düzeyini 3 çalıştırın ve haritanın oluşturulmasını bekleyin.NOT: Bu adım, analiz edilen hücre sayısına ve seçilen HSNE düzeyine bağlı olarak biraz zaman gerektirebilir. İlk HSNE düzeyinde, CD161 için pozitif hücreleri kontrol edin. CD161+ hücreleri seçin ve seçim e doğru Yakınlaştır’asağ tıklayın. İkinci düzeyde, yalnızca CD161+ olayları ile üçüncü seviyeye ulaşmak için yordamı tekrarlayın. Son tSNE haritası oluşturulduktan sonra, cytosplore tarafından tanımlanan kümeleri tSNE haritasına sağ tıklayarak kaydedin ve Kümeleri Kaydet’iseçin. Cytosplore tarafından istendiği gibi çıktı dosyalarının dizini seçin ve bu konumu not edin, çünkü bu dizin daha sonra .fcs dosyalarını R’ye yüklemek için kullanılacaktır.NOT: Sigma değeri değiştirilerek alt küme sayısı el ile değiştirilebilir. Sigma değeri varsayılan olarak 30 olarak ayarlanır; ancak, alt kümelerin gerçek sayısı girişe bağlıdır. Burada, Cytosplore her dosya bir alt kümeyi temsil eden 10 farklı alt küme algılamıştır. Çıktı dosyalarını yeniden adlandırırken basit bir ad (yalnızca karakterler) kullanın, bu da tanımlamayı ve daha fazla işlemeyi kolaylaştırır. Kaydet’i seçerek çıktı dosyalarını kaydet.NOT: Kaydedilen sonra, Cytosplore tarafından .fcs dosyaları yla birlikte bir klasör oluşturuluyor ve her dosya Cytosplore’datanımlanan kümelere karşılık geliyor. Bir sonraki adım Cytofastyardımıyla R içine dosyaları yükleme olacak. Burada, oluşturulan çıktı dosyaları Ek Dosyalar 2.1-2.10 (Cytosplore çıktı dosyaları) sağlanır. Cytosplore tarafından oluşturulan çıktı dosyalarını belirlenen işlevle R’ye yükleyin: sitosploreFCS’i hazırla.dirFCS <- "C:\\Users\\username\\Desktop\\tostudy"cfData <- readCytosploreFCS(dir = dirFCS, colNames = "açıklama") “Zaman” ve “Arka Plan” gibi bazı parametreleri kaldırarak verileri temizleyin. Gereksiz parametreleri ile ilgili sütunun konumunu kontrol edin ve matristen çıkarın.koladları(cfData@expr)cfData@expr <- cfData@expr[,-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)]NOT: Gereksiz sütunlar oluşturulan matrisin sütun adlarını okuyarak görülebilir. Koladları(cfData@expr) bir kez daha çalıştırarak, yalnızca istenilen parametrelerin elde edilmesini sağlayın. Önce soy işaretçileri, ardından işlevsel belirteçler görüntülenecek şekilde işaretçileri yeniden sırala.cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,29,40,5,30,33,11,34,14,19,32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,21,22,24,25,26,27,38,39)]NOT: Adım 2.1.8 isteğe bağlıdır. Meta veri dosyasını, klinik bilgileri içeren elektronik tablo metadosyasını yükleyerek Cytosplore’dan oluşturulan verilere bağlayın(Ek Dosya 3).kütüphane(readxl)meta <- read_excel("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")cfData@samples <- data.frame(meta)NOT: Cytosplore tarafından gerçekleştirilen kümeleme artık tamamlandı. Cytosplore için alternatif bir kümeleme seçeneği FlowSOM ve bölüm 2.2 açıklanmıştır. İki kümeleme adımından biri gerçekleştirildikten sonra görselleştirme adımına devam edin (bölüm 3). Tarafından gerçekleştirilen kümelemeFlowSOM Aşağıdaki komutu çalıştırarak Önce R’de FlowSOM’u yükleyin:if (!requireNamespace(“BiocManager”, sessizce = TRUE))install.packages(“BiocManager”)BiocManager::install(“FlowSOM”)kütüphane (FlowSOM) FlowCore paketini benzer bir yöntem kullanarak yükleyin ve aşağıdakileri çalıştırarak ortama yükleyin:if (!requireNamespace(“BiocManager”, sessizce = TRUE))install.packages(“BiocManager”)BiocManager::install(“flowCore”)kütüphane (FlowSOM) Daha önce CD161+ olaylarında, read.flowSet işlevi ile R’de kaplanmış olan Ek Dosyalar 4.1-4.8 (FCS FlowSOM girişi) ile sağlanan ham verileri yükleyin.fcs_raw <- read.flowSet(path="C:\\Users\\username\\Desktop\\tocluster", pattern = ".fcs", transformation = FALSE, truncate_max_range = FALSE, seed=123) Aşağıdaki kodda gösterildiği gibi uygun sütunları seçerek ilgili biyolojik belirteçleri seçin (“Arka Plan” veya “Zaman”) seçin ve verileri herhangi bir biyolojik işaretçiye uymayan 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51 sütunlarını kaldırın) arcsinh5 şeklinde dönüştürün. Daha önce Cytosploreile uygulandığı gibi 5 kofaktör uygulayın , aşağıdaki fonksiyonkofaktör = 5 seçerek.fcs_raw <- fsApply(fcs_raw, fonksiyon(x, cofactor=5){colnames(x) <- fcs_raw[[1]]@parameters@data$descexpr <- exprs(x)expr <- asinh(expr[,-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51)]/ kofaktör)exprs(x) <- exprreturn(x)}) FlowSOM işlevini kullanarak verileri kümele. FlowSOM ve Cytosplorekarşılaştırmak için, daha önce Cytosploretarafından verilen çıktı olarak on alt kümelerde veri kümelemek için seçin.fsom <- FlowSOM(fcs_raw, transformFunction = FALSE, ölçek = FALSE,scaled.center = FALSE, scaled.scale = FALSE, silent = FALSE, colsToUse = c(1:37),nClus = 10, maxMeta = 10, önemi = NULL, tohum = 123)NOT: Bu kullanıcı tarafından el ile değiştirilebilir. Her hücreyi tanımlanan alt kümesine ve örnek kimliğine atayın.subset_id <- as.factor(fsom$FlowSOM$map$mapping[,1])düzeyleri(subset_id) <- fsom$metakümelemebaş(subset_id) Grup atamasını içeren Meta veri dosyasını (Ek Dosya 5’temevcuttur) yükleyin ve .fcs dosyalarına bağlayın.sampleid <- read_excel("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")sampleid <- na.omit(sampleid)sampleid$sampleID <- as.factor(sampleid$sampleID)sampleid$group <- as.factor(sampleid$group)sampleid$CSPLR_ST <- as.factor(sampleid$CSPLR_ST)sampleid <- as.data.frame(sampleid)isimler(sampleid)[3] <- "sampleID"sampleID <- lapply(fsom$FlowSOM$metaData, function(x){rep(x[1], her = uzunluk(x[1]:x[2]))})attr(sampleID, ‘isimler’) <- NULLsampleID <- as.factor(unlist(sampleID))sampleid <- data.frame(sampleid)düzeyleri(sampleID) <- yapıştır("ID", 1:dim(sampleid)[1], sep="_")df <- data.frame(subset_id, sampleID, fsom$FlowSOM$data[, c(1:37)])yeniden adlandır <- data.frame(colpar=fcs_raw[[[1]]@parameters@data$desc)colnames(df) <- c("clusterID", "sampleID", rename$colpar[c(1:37)])df$ clusterID <- as.factor(df$ clusterID)df$sampleID <- as.factor(df$sampleID) Aşağıdaki komut dosyasını çalıştırarak FlowSOM’dan elde edilen veri çerçevesini temel alan bir cfList oluşturun:cfData <- cfList(numune = sampleid,expr = df) İşaretçilerin Cytosplore çözümlemesi çıktısına benzer şekilde görünmesini yeniden sırala.cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,34,36,37,10,23,24,31,22,38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,14,33,17,20,21,18,25,29,13,30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]NOT: FlowSOM tarafından kümeleme artık tamamlandı. Ardından, kümeleme çıktısının görselleştirmesini gerçekleştirin. 3. Görselleştirme: İşlem sonrası Kümeleme Analizi NOT: Bu adım, her iki kümeleme yöntemiiçin de yaygın olan bir yöntemdir. Bu nedenle, FlowSOM veya Cytosploreile kümelendikten sonra yapılabilir. Isı eşlemlerini oluşturmadan önce, aşağıdaki kodda gösterildiği gibi işlev hücre Counts’u kullanarak örnek başına sayım tablosunu oluşturun. Bazı kümeler diğerlerinden daha az hücre içerdiğinden, örnekler arasındaki dağılımkolayca görülebilsin diye işlev hücre Sayıları içinde “ölçek = DOĞRU” belirterek küme başına verileri ölçeklendirin.cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, ölçek = TRUE)NOT: Veriler artık görselleştirilebilir. Isı haritası ile görselleştirin.NOT: Bu paketin ana işlevlerinden biri, oluşturulan kümelerin fenotipini ve örneklere göre heterojenliğini görselleştirmek için kullanılan sitoHeatmaps’tir.sitoHeatmaps (cfData, group=”group”, legend=TRUE) Boxplots ile görselleştirmeNOT: Veriler, sitoBoxplots işlevini çağırarak nicel bir şekilde temsil edilebilir. Bu işlevin çıktısı her küme için her örneklemin oranını temsil eder. Adım 3.1’de yapılan hücre sayısını oluşturun, ancak her kümenin sıklığını elde etmek için verileri ölçeklendirmeyin.cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE)sitoBoxplots(cfData, grup = “grup”) Median yoğunluklu sinyal histogramı ile görselleştirmeNOT: Veriler ortanca yoğunluklu sinyal histogramını temsil ederek de görselleştirilebilir. CD45, CD11c ve CD54: Üç işaretleyicinin ifade yoğunluğunu görselleştirin. Aşağıdaki satırı arayarak istenen işaretçilerin adlarını denetleyin. İşaretçi adlarını not edin ve msiPlot işlevine ekleyin.isimler(cfData@expr)NOT: Burada CD45, CD11c ve CD54’e odaklanın. İşaretçilerin tam yazımını kontrol edin ve gerekirse ayarlayın:msiPlot(cfData, markers = c(“89Y_CD45”, “167Er_CD11c”,” 164Dy_CD54″), byGroup=’group’)