Визуализация и количественная оценка высокомерных данных цитометрии с использованием Cytofast и upstream кластерных методов FlowSOM и Cytosplore
Summary
Cytofast — это инструмент визуализации, используемый для анализа результатов кластеризации. Cytofast можно использовать для сравнения двух методов кластеризации: FlowSOM и Cytosplore. Cytofast может быстро генерировать количественный и качественный обзор данных массовой цитометрии и выявить основные различия между различными алгоритмами кластеризации.
Abstract
Сложность данных, генерируемых массовой цитометрией, потребовала новых инструментов для быстрого визуализации аналитических результатов. Методы кластеризации, такие как Cytosplore или FlowSOM, используются для визуализации и идентификации клеточных кластеров. Для анализа ниже по течению, недавно разработанный пакет R, Cytofast, может генерировать быструю визуализацию результатов от методов кластеризации. Цитофаст учитывает фенотипическую характеристику клеточных кластеров, вычисляет изобилие клеточного кластера, затем количественно сравнивает группы. Этот протокол объясняет применение Cytofast к использованию данных массовой цитометрии на основе модуляции иммунной системы в микроокружении опухоли (т.е. естественный ответ клетки убийцы )) на вызов опухоли следуют иммунотерапии (PD-L1 блокады). Демонстрация полезности Cytofast с FlowSOM и Cytosplore показано. Cytofast быстро генерирует визуальные представления групповых групповых групповых иммунных клеток и корреляции с составом иммунной системы. Различия наблюдаются в анализе кластеризации, но разделение между группами видно с помощью обоих методов кластеризации. Cytofast визуально показывает модели, индуцированные PD-L1 лечения, которые включают в себя более высокое изобилие активированных подмножеств НК ячейки, выражая более высокую интенсивность активации маркеров (т.е., CD54 или CD11c).
Introduction
Массовая цитометрия (цитометрия во время полета, или CyTOF) позволяет обнаружить широкий спектр внутриклеточных или внеклеточных биомаркеров в миллионах одиночных клеток. Высокомерный характер данных масс-цитометрии требует определенных инструментов анализа, таких как методы кластеризации клеток, такие как SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Фенограф4, VorteX5, и эшафот карты6. Кроме того, различные методы сокращения размерности были разработаны (т.е. основной анализ компонентов (PCA)7, t-распределенный стохастический сосед встраивания »t-SNE»8, иерархический стохастический сосед встраивания »HSNE»9, равномерное многообразное приближение и проекция »UMAP»10, и диффузионные карты11)для улучшения скорости измерения.
Анализ высокомерных потоков и массовых цитометрических данных часто не имеет автоматических процессов для проведения статистических тестов на кластерной частоте и связи с клиническими исходами. Ранее мы разработали R-рабочий процесс, известный как Cytofast12, который позволяет визуальный и количественный анализ вниз по течению методов кластеризации Cytosplore или FlowSOM.
Описанный здесь протокол разъясняет использование Cytofast в R и показывает, как генерировать количественные и качественные тепловые карты и графики. Кроме того, он облегчает определение связей между наблюдаемыми фенотипами иммунных и клиническими исходами. В настоящем докладе также описывается анализ конкретного набора данных масс-цитометрии с использованием двух различных процедур кластеризации: FlowSOM и Cytosplore. При использовании Cytofast с обоими методами кластеризации, соответственно показано, что фенотип активации НК-клеток находится под влиянием блокады контрольно-пропускного пункта PD-L1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytofast является быстрым вычислительным инструментом, который обеспечивает быстрое и глобальное исследование цитометрических данных путем выделения и количественной оценки конкретных клеточных подмножеств. Описанный протокол направлен на дальнейшее процесс кластеризации анализов с Cytosplore или FlowSOM. Другие инструменты анализа кластеризации подходят для Cytofast,но для этого требуется использование Cytofast для присвоения каждой ячейки подмножеству. Цитофаст,однако, не является методом кластеризации, и поэтому требует процедур кластеризации перед использованием.
Проведенный здесь анализ показал, что некоторые подмножества клеток CD161и НК в микроокружении опухоли были чувствительны к блокаде PD-L1. Об этом свидетельствуют изменения в их фенотипе и изобилии, которые наблюдались с использованием Cytosplore и FlowSOM в качестве методов кластеризации. Оба метода отличали основной кластер НК-клеток (CD11bи NKG2A) с несколько разными частотами (15%-20% для Cytosplore, 30%-40% для FlowSOM). Различия в изобилии и это приближение не повлияли на глобальную модель, поскольку обе дендрограммы, отображаемые в правых панелях рисунка 2 и рисунка 3, показали аналогичные результаты. С помощью Cytofast,таким образом, можно (независимо от метода кластеризации выбрали) для сегрегации PD-L1 обработанных и необработанных мышей на основе анализа фенотипа и изобилия нк-клеточного кластера.
В зависимости от записанных параметров необходимы изменения в протоколе. В частности, при выполнении анализа кластеризации необходимо удалить определенные параметры, такие как время и фон. Кроме того, важно, чтобы каждая ячейка была назначена подмножеству. Функция cfData просто добавит количество необработанных ячеек на кластер на образец в cfList. С этого шага, cytoheatmap может быть построен, как это объясняется в разделе 3.
Cytofast успешно используется в качестве инструмента визуализации и количественной оценки для сравнения различных методов кластеризации13. Этот пакет R также совместим с расширенными функциями, такими как globaltest14, которые могут тестировать ассоциации между группами кластеров с использованием клинических переменных. В будущем инструмент globaltest и другие алгоритмы могут быть интегрированы с Cytofast для более глубокой визуализации и количественной оценки.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем финансирование европейской комиссией премии H2020 MSCA по предложению No 675743 (ISPIC). Мы благодарим Тетье ван дер Слуис и Ирис Пардьек за тестирование протокола.
References
- Anchang, B., et al. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).
- Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).
- Levine, J. H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., et al. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Hotelling, H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. , (2008).
- Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding. Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).
- Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).
- Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data. Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).
- Beyrend, G., Stam, K., Höllt, T., Ossendorp, F., Arens, R. Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).
- Beyrend, G., et al. PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).
- Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome. Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).
