Visualisation et quantification des données de cytométrie à haute dimension à l'aide de Cytofast et des méthodes de clustering en amont FlowSOM et Cytosplore
Summary
Cytofast est un outil de visualisation utilisé pour analyser la sortie du clustering. Cytofast peut être utilisé pour comparer deux méthodes de clustering: FlowSOM et Cytosplore. Cytofast peut rapidement générer un aperçu quantitatif et qualitatif des données de cytométrie de masse et mettre en évidence les principales différences entre les différents algorithmes de clustering.
Abstract
La complexité des données générées par la cytométrie de masse a nécessité de nouveaux outils pour visualiser rapidement les résultats analytiques. Des méthodes de clustering comme Cytosplore ou FlowSOM sont utilisées pour la visualisation et l’identification des amas cellulaires. Pour l’analyse en aval, un nouveau paquet R, Cytofast, peut générer une visualisation rapide des résultats des méthodes de clustering. Cytofast prend en compte la caractérisation phénotypique des amas cellulaires, calcule l’abondance des grappes cellulaires, puis compare quantitativement les groupes. Ce protocole explique les applications de Cytofast à l’utilisation de données de cytométrie de masse basées sur la modulation du système immunitaire dans le microenvironnement tumoral (c.-à-d., la réponse cellulaire tueuse naturelle [NK]) sur le défi tumoral suivi de l’immunothérapie (blocus PD-L1). Démonstration de l’utilité de Cytofast avec FlowSOM et Cytosplore est montré. Cytofast génère rapidement des représentations visuelles des amas de cellules immunitaires liées au groupe et des corrélations avec la composition du système immunitaire. Des différences sont observées dans l’analyse de regroupement, mais la séparation entre les groupes est visible avec les deux méthodes de clustering. Cytofast montre visuellement les modèles induits par le traitement PD-L1 qui incluent une plus grande abondance de sous-ensembles activés de cellules DE NK, exprimant une intensité plus élevée des marqueurs d’activation (c.-à-d., CD54 ou CD11c).
Introduction
La cytométrie de masse (cytométrie par heure de vol, ou CyTOF) permet la détection d’un large éventail de biomarqueurs intracellulaires ou extracellulaires dans des millions de cellules individuelles. La nature de haute dimension des données de cytométrie de masse nécessite certains outils d’analyse, tels que les techniques de regroupement cellulaire comme SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5, et les cartes d’échafaudage6. En outre, diverses techniques basées sur la réduction de la dimensionnalité ont été développées (c.-à-d., l’analyse des composants principaux [PCA]7, t-distribué voisin stochastique intégrant [t-SNE]8, voisin stochastique hiérarchique intégrant [HSNE]9, approximation et projection multiples uniformes [UMAP]10, et cartes de diffusion11) pour améliorer la vitesse, l’interprétation et la visualisation des jeux de données de haute dimension.
L’analyse en aval des données cytométriques de débit et de masse de grande dimension manque souvent de processus automatiques pour effectuer des tests statistiques sur la fréquence des grappes et des liens avec les résultats cliniques. Auparavant, nous avons développé un flux de travail Basé sur R connu sous le nom Cytofast12, qui permet des analyses visuelles et quantitatives en aval des techniques de clustering par Cytosplore ou FlowSOM.
Le protocole décrit ici clarifie l’utilisation de Cytofast en R et montre comment générer des cartes thermiques quantitatives et qualitatives et des graphiques. En outre, il facilite la détermination des connexions entre les phénotypes immunitaires observés et les résultats cliniques. Ce rapport décrit également l’analyse d’un jeu de données de cytométrie de masse spécifique à l’aide de deux procédures de clustering différentes : FlowSOM et Cytosplore. En utilisant Cytofast avec les deux méthodes de clustering, il est en conséquence démontré que le phénotype d’activation des cellules NK est influencé par le blocus de point de contrôle immunitaire PD-L1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytofast est un outil de calcul rapide qui fournit une exploration rapide et globale des données cytométriques en mettant en évidence et en quantifiant des sous-ensembles cellulaires spécifiques au traitement. Le protocole décrit vise à traiter davantage les analyses de regroupement avec Cytosplore ou FlowSOM. D’autres outils d’analyse de clustering sont appropriés pour Cytofast,mais cela nécessite l’utilisation de Cytofast pour assigner chaque cellule à un sous-ensemble. Cytofast, cependant, n’est pas une méthode de clustering, et nécessite donc des procédures de regroupement avant utilisation.
L’analyse effectuée ici a montré que certains sous-ensembles de cellules CD161et NK dans le microenvironnement tumoral étaient sensibles à un blocus PD-L1. Ceci a été démontré par des changements dans leur phénotype et leur abondance, qui ont été observés en utilisant à la fois Cytosplore et FlowSOM comme méthodes de regroupement. Les deux méthodes distinguaient le cluster cellulaire principal de NK (CD11bet NKG2A) avec des fréquences légèrement différentes (15 % à 20 % pour Cytosplore, 30 % à 40 % pour FlowSOM). Les différences d’abondance et cette approximation n’ont pas eu d’incidence sur le modèle global, car les deux dendrogrammes affichés dans les panneaux droits de la figure 2 et de la figure 3 ont donné des résultats similaires. En utilisant Cytofast, il est donc possible (indépendant de la méthode de clustering choisie) de séparer les souris traitées par PD-L1 et non traitées sur la base d’analyses de phénotype et d’abondance des amas de cellules NK.
Selon les paramètres enregistrés, des modifications au protocole sont nécessaires. Plus précisément, certains paramètres tels que le temps et l’arrière-plan doivent être supprimés lors de l’analyse de clustering. En outre, il est important que chaque cellule soit assignée à un sous-ensemble. La fonction cfData ajoutera simplement les numérations cellulaires brutes par cluster par échantillon dans la liste cfList. À partir de cette étape, la cytoheatmap peut être construite comme expliqué dans la section 3.
Cytofast a été utilisé avec succès comme outil de visualisation et de quantification pour comparer différentes méthodes de clustering13. Ce paquet R est également compatible avec des fonctionnalités avancées, telles que le globaltest14, qui peut tester les associations entre les groupes de clusters en utilisant des variables cliniques. À l’avenir, l’outil globaltest et d’autres algorithmes pourront être intégrés à Cytofast pour une visualisation et une quantification plus approfondies.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le financement par la Commission européenne d’un prix H2020 MSCA sous la proposition numéro 675743 (ISPIC). Nous remercions Tetje van der Sluis et Iris Pardieck d’avoir testé le protocole.
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