Visualização e quantificação de dados de citometria de alta dimensão usando Cytofast e os métodos de agrupamento upstream FlowSOM e Cytosplore

Todas as experiências com animais foram aprovadas pelo Comitê de Experimentos Animais da LUMC e foram executadas de acordo com as diretrizes de experimentação animal do LUMC em conformidade com as diretrizes dos comitês holandeses e europeus. NOTA:Para configuração experimental, camundongos C57BL/6 foram subcutâneamente inoculados no flanco direito com o tumor de cólon murine MC38 a uma concentração de 0,3 x 106 células/200 μL de soro lógico tampão de fosfato (PBS). Após 10 dias, quando os tumores eram palpáveis, os camundongos foram tratados com anticorpos de bloqueio pd-L1 (clone MIH-5, 200 μg/mouse, injeção intra-peritoneal) ou foram tratados com maquetes. Os tumores foram ressecados 3 dias depois, após a injeção de PD-L1, processado ex vivo, e analisados pela citometria de massa CyTOF usando 38 marcadores13. 1. Equipamentos e Software para Análise de Dados NOTA:Use um computador (Windows 7 ou mais novo) e processador I5 em 2,4 GHz ou equivalente, memória instalada RAM 6 GB, e 10 GB de espaço de disco rígido gratuito. O pacote R Cytofast usa funções existentes: principalmente flowCore, pheatmape ggplot. As linhas de comando a serem executadas em R estão incluídas no protocolo. O recurso para instruções R pode ser encontrado em https://education.rstudio.com/. Para instalar o pacote Cytofast, inicie R (versão “3.6”) e instale a versão Bioconductor 3.9, inserindo o seguinte código:se (!requireNamespace (“BiocManager”, silenciosamente = TRUE))install.packages (“BiocManager”)BiocManager::instalar (“cytofast”) Certifique-se de que o pacote seja carregado no ambiente desejado, executando o seguinte:biblioteca (cytofast) 2. Criando clusters NOTA:Para mostrar os dois métodos de agrupamento Cytosplore e FlowSOM com Cytofast,as células NK (CD161+) no microambiente tumoral 3 dias após o tratamento PD-L1 são analisados. Agrupamento realizado porCytosplore Depois de baixar e instalar cytosplore, hospedado em <www. Cytosplore.org>, carregar os arquivos .fcs(Arquivos Suplementares 1.1-1.8 [Arquivos de entrada Cytosplore]) clicando Arquivo | Arquivo FCS Aberto (s) em Cytosplore. Adicione uma marca de exemplo única como canal clicando adicionar a marca de exemplo única como canal quando solicitado e selecione um cofator para transformação de arcosinh hiperbólico (padrão é 5). Selecione Run H-SNE,executar um nível de HSNE de 3, e esperar que o mapa seja gerado.NOTA:Esta etapa pode exigir algum tempo, dependendo do número de células analisadas e do nível de HSNE escolhido. No primeiro nível hsne, verifique as células que são positivas para CD161. Selecione o CD161+ células e zoom clique direito em seleção. No segundo nível, repita o procedimento para atingir o terceiro nível com apenas CD161+ eventos. Uma vez que o último mapa tSNE é gerado, salvar os clusters definidos por Cytosplore por direito clicando no mapa tSNE e escolher Save Clusters. Escolha o diretório dos arquivos de saída, conforme solicitado por Cytosplore e observe este local, porque este diretório será então usado para carregar os arquivos .fcs em R.NOTA:O número de subconjuntos pode ser alterado manualmente alterando o valor sigma. O valor sigma é definido por padrão em 30; no entanto, o número real de subconjuntos depende da entrada. Aqui, Cytosplore detectou 10 subconjuntos diferentes, com cada arquivo representando um subconjunto. Use um nome simples (apenas caracteres) ao renomear os arquivos de saída, o que facilitará a identificação e o manuseio adicional. Salve os arquivos de saída selecionando Save.NOTA:Depois de salvar, uma pasta está sendo criada pela Cytosplore com os arquivos .fcs, com cada arquivo correspondente aos clusters identificados em Cytosplore. O próximo passo será carregar os arquivos em R com a ajuda de Cytofast. Aqui, os arquivos de saída gerados são fornecidos em Arquivos Suplementares 2.1-2.10 (arquivos de saída Cytosplore). Carregue os arquivos de saída gerados pela Cytosplore em R com a função designada: readCytosploreFCS.dirFCS <- "C:\\Users\\username\\Desktop\\tostudy"cfData <- readCytosploreFCS (dir = dirFCS, colNames = "descrição") Limpe os dados removendo alguns parâmetros, como “Tempo” e “Fundo”. Verifique a posição da coluna relacionada aos seus parâmetros desnecessários e retire-a da matriz.colnomes (cfData@expr)cfData@expr <- cfData@expr[,-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)]NOTA:As colunas desnecessárias podem ser vistas lendo os nomes das colunas da matriz gerada. Ao executar colnomes (cfData@expr) mais uma vez, garantir que apenas os parâmetros desejados são obtidos. Re-encomendar os marcadores para que os marcadores de linhagem são exibidos em primeiro lugar, seguido por marcadores funcionais.cfData@expr e cfData@expr,c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,29,40,5,30,33,11,34,14,19,32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,21,22,24,25,26,27,38,39)]NOTA:Passo 2.1.8 é opcional. Vincule o arquivo de dados meta aos dados gerados da Cytosplore, carregando o metaarquivo de planilha contendo informações clínicas(Arquivo Suplementar 3).biblioteca (readxl)meta <- read_excel ("C:\\Users\\username\\desktop\\sample_id.xlsx")cfData@samples <- data.frame (meta)NOTA:O agrupamento que está sendo realizado por Cytosplore está agora terminado. Uma opção alternativa de agrupamento para Cytosplore é FlowSOM e é descrita na seção 2.2. Uma vez realizada uma das duas etapas de agrupamento, prossiga com a etapa de visualização (seção 3). Agrupamento realizado porFlowSOM Instale pela primeira vez o FlowSOM em R, executando o seguinte comando:se (!requireNamespace (“BiocManager”, silenciosamente = TRUE))install.packages (“BiocManager”)BiocManager::instalar (“FlowSOM”)biblioteca (FlowSOM) Instale o pacote flowCore usando um método semelhante e carregue-o no ambiente executando o seguinte:se (!requireNamespace (“BiocManager”, silenciosamente = TRUE))install.packages (“BiocManager”)BiocManager::instalar (“flowCore”)biblioteca (FlowSOM) Carregue os dados brutos fornecidos em Arquivos Suplementares 4.1-4.8 (entrada FCS FlowSOM), que foram previamente fechados em eventos CD161+, em R com a função read.flowSet.fcs_raw <- read.flowSet (path="C:\\Users\\username\\Desktop\\tocluster", padrão = ".fcs", transformação = FALSE, truncate_max_range = FALSE, semente=123) Selecione os marcadores biológicos relevantes (remover “Background” ou “Time”) selecionando as colunas adequadas e transforme os dados de forma arcsinh5, como mostrado no código abaixo (aqui, remova as colunas 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, que não correspondem a nenhum marcador biológico). Aplique um cofator de 5 como aplicado anteriormente com Cytosplore,escolhendo cofator=5 na função abaixo.fcs_raw <- fsApply (fcs_raw, função (x, cofactor=5){colnames (x) <- fcs_raw[[1]]] @parameters@data$descexpr <- exprs (x)expr <- asinh (expr[,-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,35,37,38,51)/cofactor)exprs (x) <- exprretorno (x)}) Cluster os dados usando a função FlowSOM. Para comparar FlowSOM e Cytosplore,opte por agrupar os dados em dez subconjuntos como a saída anteriormente produzida pela Cytosplore.fsom <- FlowSOM (fcs_raw, transformFunction = FALSE, scale = FALSE,scaled.center = FALSE, scaled.scale = FALSE, silent = FALSE, colsToUse = c(1:37),nClus = 10, maxMeta = 10, importância = NUL, semente = 123)NOTA:Isso pode ser alterado manualmente pelo usuário. Atribuir cada célula ao seu subconjunto identificado e identificação da amostra.subset_id <- as.factor (fsom$FlowSOM$map$mapping[,1])níveis (subset_id) <- fsom$metaclusteringcabeça (subset_id) Carregue o arquivo de metadados em R (disponível no Arquivo Suplementar 5)contendo a atribuição do grupo e vincule-o aos arquivos .fcs.sampleid <- read_excel ("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")sampleid <- na.omit (sampleid)sampleid$sampleID <- as.factor (sampleid$sampleID)sampleid$group <- as.factor (sampleid$group)sampleid$CSPLR_ST <- as.factor (sampleid$CSPLR_ST)sampleid <- as.data.frame (sampleid)nomes (sampleid)[3] <- "sampleID"sampleID <- lapply (fsom$FlowSOM$metaData, função (x){rep (x[1], cada = comprimento (x[1]:x[2]))})attr (sampleID, ‘names’) <- NULLsampleID <- as.factor (unlist (sampleID))sampleid <- data.frame (sampleid)níveis (sampleID) <- colar ("ID", 1:dim (sampleid)[1], sep="_")df <- data.frame (subset_id, sampleID, fsom$FlowSOM$data[, c (1:37)])renome <- data.frame (colpar=fcs_raw[[1]]] @parameters@data$desc)colnames (df) <- c ("clusterID", "sampleID", rebatizar$colpar[c(1:37)])df$ clusterID <- as.factor (df$ clusterID)df$sampleID <- as.factor (df$sampleID) Crie uma cfList com base no quadro de dados obtido da FlowSOM executando o seguinte script:cfData <- cfList (samples = sampleid, cfData <- cfList (samples = sampleid, cfData <- cfList (samples = sampleid, cfDataexpr = df) Reordenar os marcadores para aparecer de forma semelhante à saída da análise Cytosplore.cfData@expr e cfData@expr,c(1,2,34,36,37,10,23,24,32, 22, 22,38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,14,33,17,20,21,18,25,29,13,30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]NOTA:O agrupamento por FlowSOM está agora terminado. Em seguida, realize a visualização da saída de agrupamento. 3. Visualização: Análise de Agrupamento pós-processamento NOTA:Esta etapa é um método que seja comum a ambos os métodos de agrupamento. Portanto, ele pode ser realizado após clustering com FlowSOM ou Cytosplore. Antes de criar os mapas de calor, gere a tabela de contagem por amostra usando a função cellCounts como mostrado no código abaixo. Uma vez que alguns clusters contêm menos células do que outras, dimensionar os dados por cluster, especificando “escala = TRUE” dentro da função cellCounts, de modo que a dispersão entre as amostras pode ser facilmente visto.cfData <- cellCounts (cfData, frequency = TRUE, scale = TRUE) cfData <- cellCounts (cfData, frequency = TRUE, scale = TRUE) cfData <- cellCounts (cfData, frequency = TRUE, scale = TRUE) cfDataNOTA:Os dados agora podem ser visualizados. Visualize com mapa de calor.NOTA:Uma das principais funções deste pacote é cytoHeatmaps, que é usado para visualizar o fenótipo dos clusters criados, bem como a sua heterogeneidade em relação às amostras.cytoHeatmaps (cfData, group=”group”, legend=TRUE) Visualização com enredos de caixaNOTA:Os dados podem ser representados de forma quantitativa, chamando a função cytoBoxplots. A saída desta função representa a proporção de cada amostra para cada cluster. Gere a contagem celular como feito na etapa 3.1, mas não dimensione os dados para obter a frequência de cada cluster.cfData <- cellCounts (cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE) cfData <- cellCounts (cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE) cfData <- cellCounts (cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE) cfDatacytoBoxplots (cfData, grupo = “grupo”) Visualização com intensidade mediana sinaliza histogramaNOTA:Os dados também podem ser visualizados representando o histograma de sinal de intensidade mediana. Visualize a intensidade de expressão de três marcadores: CD45, CD11c e CD54. Verifique os nomes dos marcadores desejados, chamando a seguinte linha. Observe os nomes dos marcadores e inclua-o na função msiPlot.nomes (cfData@expr)NOTA:Aqui, concentre-se em CD45, CD11c e CD54. Verifique a ortografia exata dos marcadores e ajuste, se necessário:msiPlot (cfData, marcadores = c(“89Y_CD45”, “167Er_CD11c”, “164Dy_CD54”), pelo Group=’group’)