Visualización y cuantificación de datos de citometría de alta dimensión mediante citorápido y los métodos de agrupación en clústeres ascendentes FlowSOM y Cytosplore
Summary
Cytofast es una herramienta de visualización utilizada para analizar la salida de la agrupación en clústeres. Cytofast se puede utilizar para comparar dos métodos de agrupación en clústeres: FlowSOM y Cytosplore. Cytofast puede generar rápidamente una visión cuantitativa y cualitativa de los datos de citometría de masa y resaltar las principales diferencias entre los diferentes algoritmos de agrupación en clústeres.
Abstract
La complejidad de los datos generados por la citometría masiva ha requerido nuevas herramientas para visualizar rápidamente los resultados analíticos. Los métodos de agrupación en clústeres como Cytosplore o FlowSOM se utilizan para la visualización e identificación de clústeres de celdas. Para el análisis posterior, un paquete de R recientemente desarrollado, Cytofast, puede generar una visualización rápida de los resultados de los métodos de agrupación en clústeres. Cytofast tiene en cuenta la caracterización fenotípica de los clústeres de células, calcula la abundancia del clúster de celdas y, a continuación, compara cuantitativamente los grupos. Este protocolo explica las aplicaciones de Citofast al uso de datos de citometría de masabasados en la modulación del sistema inmunitario en el microambiente tumoral (es decir, la respuesta celular del asesino natural [NK]) al desafío tumoral seguido de la inmunoterapia (bloqueo PD-L1). Se muestra la demostración de la utilidad del citorápido con FlowSOM y Cytosplore. El citorápido genera rápidamente representaciones visuales de cúmulos de células inmunitarias relacionadas con el grupo y correlaciones con la composición del sistema inmunitario. Las diferencias se observan en el análisis de agrupación en clústeres, pero la separación entre grupos es visible con ambos métodos de agrupación en clústeres. El citorápido muestra visualmente los patrones inducidos por el tratamiento PD-L1 que incluyen una mayor abundancia de subconjuntos de células NK activados, expresando una mayor intensidad de los marcadores de activación (es decir, CD54 o CD11c).
Introduction
La citometría masiva (citometría por tiempo de vuelo, o CyTOF) permite la detección de una amplia gama de biomarcadores intracelulares o extracelulares en millones de células individuales. La naturaleza de alta dimensión de los datos de citometría de masas requiere ciertas herramientas de análisis, como las técnicas de agrupación de células como SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5y scaffold maps6. Además, se han desarrollado diversas técnicas basadas en la reducción de dimensionalidad (es decir, análisis de componentes principales [PCA]7,incrustación de vecino estocástico distribuido en t [t-SNE]8, incrustación jerárquica de vecinos estocásticos [HSNE]9, aproximación y proyección uniformes [UMAP]10,y mapas de difusión11) para mejorar la velocidad, interpretación y visualización de conjuntos de datos de alta dimensión.
El análisis posterior de los datos citométricos de masa y flujo de alta dimensión a menudo carece de procesos automáticos para realizar pruebas estadísticas sobre la frecuencia del clúster y los vínculos con los resultados clínicos. Anteriormente, desarrollamos un flujo de trabajo basado en R conocido como Cytofast12,que permite análisis visuales y cuantitativos posteriores de las técnicas de clustering por Cytosplore o FlowSOM.
El protocolo descrito aquí aclara el uso de Cytofast en R y muestra cómo generar mapas de calor cuantitativos y cualitativos y gráficos. Además, facilita la determinación de las conexiones entre los fenotipos inmunes observados y los resultados clínicos. Este informe también describe el análisis de un conjunto de datos de citometría de masa específico mediante dos procedimientos de agrupación en clústeres diferentes: FlowSOM y Cytosplore. Mediante el uso de citorápido con ambos métodos de agrupación en clústeres, se muestra correspondientemente que el fenotipo de activación de las células NK está influenciado por el bloqueo del punto de control inmune PD-L1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytofast es una herramienta computacional rápida que proporciona una exploración rápida y global de los datos citométricos resaltando y cuantificando subconjuntos celulares específicos del tratamiento. El protocolo descrito tiene como objetivo seguir procesando análisis de clustering con Cytosplore o FlowSOM. Otras herramientas de análisis de agrupación en clústeres son adecuadas para Cytofast, pero esto requiere el uso de Cytofast para asignar cada celda a un subconjunto. Cytofast, sin embargo, no es un método de agrupación en clústeres y, por lo tanto, requiere procedimientos de agrupación en clústeres antes de su uso.
El análisis realizado aquí mostró que ciertos subconjuntos de células CD161+ NK en el microambiente tumoral eran sensibles a un bloqueo PD-L1. Esto fue evidenciado por los cambios en su fenotipo y abundancia, que se observaron utilizando Cytosplore y FlowSOM como métodos de agrupación en clústeres. Ambos métodos distinguieron el clúster principal de células NK (CD11b+ NKG2A+) con frecuencias ligeramente diferentes (15%–20% para Cytosplore,30%–40% para FlowSOM). Las diferencias en abundancia y esta aproximación no afectaron al patrón global, porque ambos dendrogramas mostrados en los paneles derecho de la Figura 2 y la Figura 3 mostraron resultados similares. Por lo tanto, mediante el uso de Citofast, es posible (independientemente del método de agrupación en clústeres elegido) segregar ratones tratados con PD-L1 y no tratados en función de los análisis del fenotipo y la abundancia del racimo de células NK.
Dependiendo de los parámetros registrados, se necesitan modificaciones en el protocolo. En concreto, se deben quitar determinados parámetros, como el tiempo y el fondo, al realizar el análisis de agrupación en clústeres. Además, es importante que cada celda se asigne a un subconjunto. La función cfData simplemente agregará los recuentos de celdas sin procesar por clúster por muestra en cfList. A partir de este paso, el citoheatmap se puede construir como se explica en la sección 3.
Cytofast se ha utilizado con éxito como herramienta de visualización y cuantificación para comparar diferentes métodos de agrupación en clústeres13. Este paquete R también es compatible con características avanzadas, como el globaltest14,que puede probar asociaciones entre grupos de clústeres utilizando variables clínicas. En el futuro, la herramienta globaltest y otros algoritmos se pueden integrar con Cytofast para una visualización y cuantificación más detalladas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos la financiación de la Comisión Europea de un premio H2020 MSCA con el número de propuesta 675743 (ISPIC). Agradecemos a Tetje van der Sluis e Iris Pardieck por probar el protocolo.
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